微小核糖核酸在急性心肌梗死診斷和治療中作用的研究進(jìn)展

摘要 近年來，隨著分子生物學(xué)研究方法的飛速發(fā)展，急性心肌梗死（AMI）的機(jī)制研究在分子生物學(xué)水平取得了長足的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（miRNA）表達(dá)異常在AMI發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，并可能是AMI早期診斷的標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)。本文將重點(diǎn)介紹幾種與AMI發(fā)病關(guān)系密切的miRNA，并將近年來miRNA作為AMI診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展做一綜述。

作者單位：730000 甘肅省蘭州市，蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科 甘肅省心血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

作者簡介：唐宇寧 碩士研究生 研究方向?yàn)閯用}粥樣硬化的基礎(chǔ)與臨床研究 Email:Tangyn.lzu@gmail.com 通訊作者： 張鉦 Email:zhangccu@163.com

微小核糖核酸（miRNA）是一類大小為19～25個堿基的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，研究表明編碼蛋白的基因總數(shù)不到3萬個，而非編碼RNA基因約占整個人類基因組的98%，其中編碼的miRNA超過1 000種，負(fù)責(zé)調(diào)控哺乳類動物編碼基因的30% [1]。探討miRNA在人類疾病中作用的研究始于白血病，其后對腫瘤、糖尿病以及免疫系統(tǒng)疾病均有研究。近年來，miRNA在心血管領(lǐng)域尤其是對急性心肌梗死（AMI）調(diào)控作用的研究取得了很大進(jìn)展 [2, 3]。

1 微小核糖核酸在急性心肌梗死發(fā)病機(jī)制中的作用

miR-1和miR-133主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡來影響AMI發(fā)病過程中心肌細(xì)胞的存亡。多項(xiàng)研究表明，這兩種miRNA 在AMI發(fā)生后短期內(nèi)即持續(xù)顯著升高。miR-1是一類肌細(xì)胞特異性miRNA，過度表達(dá)時可通過抑制下游增殖相關(guān)靶基因如RasGAP、Cdk9和Rheb的表達(dá)，進(jìn)而抑制心室肌細(xì)胞增殖。Xu等 [4]在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2大鼠心室肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-1促凋亡而miR-133抑制凋亡。miR-1的靶點(diǎn)為熱休克蛋白（HSP）60和HSP70基因的3'非翻譯區(qū)，它能降低HSP60和HSP70蛋白水平，但不改變其轉(zhuǎn)錄；miR-133在整個Caspase-9基因序列中可能有多個靶位點(diǎn)，在蛋白和信使核糖核酸（mRNA）水平都能抑制Caspase-9的表達(dá)，這可能是細(xì)胞調(diào)節(jié)凋亡與存活的機(jī)制之一。研究顯示，當(dāng)心肌細(xì)胞處于促凋亡（如缺血和氧化應(yīng)激）環(huán)境時，miR-1水平會病理性升高。

miR-499、miR-208a和miR-208b在不穩(wěn)定性心絞痛和AMI發(fā)生時也顯著增高。miR-499是由β-肌球蛋白重鏈基因Myh7b的19內(nèi)含子編碼的。基因敲除研究顯示，miR-499和另一個心肌miRNA——miR-208b功能相似，都通過激活緩慢肌纖維基因和抑制快速肌纖維基因來調(diào)節(jié)肌球蛋白的表達(dá)，且兩者均受miR-208a的調(diào)節(jié) [5]。轉(zhuǎn)基因過表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，miR-499能通過靶向調(diào)節(jié)親肥大磷酸酶來發(fā)揮心肌保護(hù)作用 [6]，也能調(diào)節(jié)早期應(yīng)激反應(yīng)基因而使心臟功能障礙 [7]，因此，miR-499在心臟中的功能和它的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的后果，目前還不清楚。人類肌肉富含miR-1、miR-133a和miR-499，而miR-208為心肌特異表達(dá)的miRNA，且在激素調(diào)節(jié)的心肌生長中起重要作用。miR-208來自于心肌特異α-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）基因mRNA前體的第27個內(nèi)含子。因此，位于內(nèi)含子中的miRNA與其宿主基因由于來源于同一個轉(zhuǎn)錄本而有著相似的表達(dá)譜。研究者通過基因芯片分析心臟條件性miR-208敲除小鼠模型后發(fā)現(xiàn)，miR-208可能通過抑制正常心臟中不表達(dá)的快骨骼肌收縮蛋白基因來維持心肌細(xì)胞的收縮表型。進(jìn)一步研究顯示，在應(yīng)激狀態(tài)下，miR-208通過抑制靶基因甲狀腺素受體相關(guān)蛋白1的表達(dá)從而調(diào)控心肌肥厚、纖維化以及β-MHC的表達(dá)。因此，α-MHC不僅僅只是心肌收縮蛋白，它還包括一個能夠調(diào)控激素刺激的心肌生長和基因表達(dá)的miRNA。

作為miRNA中的一員，Let-7g能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β （TGF-β）來對內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)性作用，同時可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白，進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化（AS）的發(fā)展。在體外實(shí)驗(yàn)中，Let-7g能抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，并通過下調(diào)TGF-β來抑制纖溶酶原激活抑制劑-1 （PAI-1）的表達(dá)，同時可增加同源基因的表達(dá)來降低內(nèi)皮細(xì)胞的敏感性；在活體內(nèi)，給高血脂的載脂蛋白E基因敲除小鼠注射Let-7g抑制劑會增加TGF-β誘導(dǎo)的基因（包括PAI-1基因）在血管內(nèi)的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞在頸動脈的滲透性，并導(dǎo)致頸動脈內(nèi)膜中層增厚；腔隙性腦卒中患者的血清Let-7g低水平與血漿PAI-1高水平有關(guān)。由此推論，Let-7g可能是內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵內(nèi)生抑制劑，當(dāng)缺乏Let-7g時，內(nèi)皮細(xì)胞獲得促炎性表型，引發(fā)血管損傷并激活血小板 [8]。

2 微小核糖核酸在急性心肌梗死診斷中的作用

血清miRNA被認(rèn)為是一種理想的診斷標(biāo)記物，因其與血漿中的囊泡、高密度脂蛋白膽固醇、Ago2蛋白以及核仁磷酸蛋白1等形成復(fù)合物，或存在于凋亡小體中而十分穩(wěn)定，能承受住反復(fù)的凍結(jié)—融解循環(huán)，并能抵抗核糖核酸酶的降解 [9]，且血漿中miRNA水平不受臨床相關(guān)因素的影響，如年齡、性別、體重指數(shù)、腎功能、收縮壓以及白細(xì)胞計(jì)數(shù)等。此外，血清miRNA具備標(biāo)志物的大多數(shù)特點(diǎn)：無創(chuàng)檢測、高敏感度和特異度、病變早期即可檢測到、隨病變程度有時間性的改變、半衰期長且檢測迅速等。

Liebetrau等 [10]對肥厚型梗阻性心肌病患者采用經(jīng)冠狀動脈的室間隔肥厚消融術(shù)，得到了冠狀動脈閉塞后循環(huán)中特定miRNA的出現(xiàn)時間。在冠狀動脈閉塞后僅僅15 min，miR-1和miR-133濃度就開始上升，且在74 min達(dá)到平臺期，這可能能為非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）的早期識別作出貢獻(xiàn)。Wang等 [11]用反轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測了AMI患者在發(fā)作24 h和6 d后的全血和血漿中miR-133和miR-328水平，發(fā)現(xiàn)這兩種miRNA在AMI患者血漿中的水平均顯著高于正常對照組人群。另一研究發(fā)現(xiàn)，STEMI患者體內(nèi)miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-499-5p會迅速上調(diào)，其中miR-133a最顯著，與對照組相比升高了140倍 [12]。 有研究表明，miR-133a在STEMI患者體內(nèi)濃度升高與大面積心肌梗死、心肌再灌注損傷以及心肌挽救減少有關(guān) [13]。miR-1、miR-133a和miR-133b升高和達(dá)峰時間與心肌肌鈣蛋白I同步，miR-499-5p則稍微滯后，在發(fā)病第5 d時miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-499-5p和miR-375都恢復(fù)到正常水平，而miR-122直至第30 d仍未恢復(fù) [14]。

miR-1、miR-133a和miR-208a能在AMI發(fā)生4 h內(nèi)持續(xù)性升高，在心肌肌鈣蛋白T前達(dá)到高峰，先于傳統(tǒng)標(biāo)志物。miR-208a尤其適合作為標(biāo)志物，因?yàn)樗切呐K特異的，在健康人群和非AMI患者血漿中為陰性，而在AMI患者中檢出率高達(dá)90.9%，而miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-208b和miR-499在不穩(wěn)定性心絞痛和AMI患者中均可檢測到。在冠狀動脈閉塞1 h后，miR-208a即顯著升高并可檢出 [15]。因此，miR-208a對AMI的診斷具有較高的敏感性和特異性。此外，有研究者比較了NSTEMI老年患者和急性心力衰竭但不伴有AMI的老年患者血漿中miRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSTEMI患者血漿中miR-1、miR-21和miR-133a顯著高于正常對照人群，且 miR-21和miR-499-5p水平顯著高于急性心力衰竭組，其診斷的精確性高于高敏心肌肌鈣蛋白T。

Vogel等 [16]研究了全基因組miRNA的動力學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)有多種miRNA可能是AMI的標(biāo)志物，提示我們或可用一組miRNA來作為AMI診斷標(biāo)志物，如聯(lián)合檢測miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-208a，以提高準(zhǔn)確性。未來需要更多的研究來確定哪些miRNA在早期診斷方面可優(yōu)于肌鈣蛋白，尤其是在肌鈣蛋白邊界性升高、心電圖改變和癥狀不典型的患者，以及AMI的排除診斷。然而，miRNA的靶作用具有多效性，它的特異性到底能否優(yōu)于高敏心肌肌鈣蛋白，目前還未可知。用外周血miRNA作診斷標(biāo)志物還有許多問題亟待解決，如抗凝藥和抗血小板藥物對miRNA的干擾；此外，miRNA在血清、血漿和全血中均穩(wěn)定存在，但在RNA分離和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量分析中會逐漸減少，有學(xué)者認(rèn)為血清可能是最適樣本，因?yàn)檠蹇梢员苊獍准?xì)胞導(dǎo)致的偏倚；另一個重要的問題是，miRNA的檢測技術(shù)需要標(biāo)準(zhǔn)化，有研究用miR-17來標(biāo)化樣本 [12]，然而另有研究表明miR-17在急性冠狀動脈綜合征患者體內(nèi)也有升高 [17]，且已知miR-17-92簇受局部缺血和炎癥因子的調(diào)節(jié)，因此miR-17用于標(biāo)化的準(zhǔn)確性也有待商榷。此外，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)也是限制miRNA應(yīng)用的一個重要方面，miRNA序列的擴(kuò)增依靠寡核苷酸，然而擴(kuò)增時如果滴定不當(dāng)可能導(dǎo)致偽影，數(shù)字多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)能相對提高miRNA定量的精確度。最后，以目前的技術(shù)水平，miRNA的分離以及隨后的反轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量仍需大量時間，要使miRNA廣泛用于臨床，需迅速有效得出結(jié)果，即最好能在床旁檢測。

關(guān)于miRNA能否作為AMI的預(yù)后指標(biāo)，目前知之甚少。有研究檢測了AMI患者的6種肌肉中富集的miRNA，發(fā)現(xiàn)與穩(wěn)定性心絞痛患者相比，AMI患者的miR-1、miR-133a 和miR-208b水平顯著升高；單因素分析揭示，miR-133a和miR-208b水平與死亡風(fēng)險顯著相關(guān) [18]。但是，經(jīng)高敏心肌肌鈣蛋白T調(diào)整后并未發(fā)現(xiàn)獨(dú)立的預(yù)后意義。

3 微小核糖核酸在急性心肌梗死治療中的作用

心臟miRNA能夠影響細(xì)胞死亡、心肌電生理功能、心肌原始細(xì)胞增殖和分化、血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)成分，因此，針對miRNA的治療能夠?yàn)楦淖傾MI的病理生理過程提供機(jī)會。以miRNA 為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物，補(bǔ)充表達(dá)下調(diào)的miRNA 或抑制過多表達(dá)的miRNA，將可能有效阻止AS的進(jìn)展，同時也為AMI治療帶來新希望。如前文中提到的，既然Let-7g能抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，Let-7g類似物很可能對AS發(fā)揮治療作用。此外，在載脂蛋白E敲除的小鼠體內(nèi)，miR-181b能抑制炎癥和AS，miR-146也可抑制內(nèi)皮炎癥激活，故而補(bǔ)充miR-181b或miR-146也可能起到抑制AS的作用。miR-1促凋亡而miR-133抑制凋亡，這提示miR-1和miR-133的相對水平比絕對水平更重要：升高miR-1和（或）降低miR-133水平有利于細(xì)胞凋亡，減少miR-1和（或）增高miR-133水平有利于存活 [4]，調(diào)節(jié)miR-1與miR-133的相對水平，也可起到提高心肌細(xì)胞存活率的作用。

miRNA在治療方面的探索主要通過過表達(dá)和抑制途徑,使用病毒載體生產(chǎn)miRNA以及寡核苷酸miRNA類似物的研究仍在進(jìn)行。與之相比，用反轉(zhuǎn)錄方法來抑制基因表達(dá)的研究更為成熟：通過化學(xué)修飾作用，提高miRNA拮抗劑（反義寡核苷酸）與miRNA的親和力，并獲得核酸酶抵抗性、蛋白結(jié)合能力（硫代磷酸酯主鏈連接）和細(xì)胞攝取能力（2'-O-甲基-膽固醇-共軛）。鎖核酸是8個或15個堿基的反義分子，具有2'修飾的糖基（2'-氟和2'-O-甲氧基乙基），使其對靶序列的親和力明顯升高。但有報道提出，鎖核酸能誘導(dǎo)補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)、激活固有免疫并有肝毒性 [19]。

由于miRNA靶作用的多效性，它們對人體的調(diào)節(jié)作用是不可預(yù)估的，還有諸如miRNA類似物的精確調(diào)節(jié)、根據(jù)不同個體危險因素的miRNA拮抗劑的生產(chǎn)等多個問題并未解決，對其進(jìn)一步研究將豐富我們對心血管生理和疾病的認(rèn)識，并推動和拓展心血管疾病的治療思路和方法。

4 小結(jié)與展望

miRNA在AMI發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，但尚需更多研究來深入探討miRNA的作用范圍、對miRNA活性的干預(yù)措施的安全性，以及這些基礎(chǔ)研究在具體疾病中的實(shí)際應(yīng)用價值。同時，由于目前臨床研究中所納入研究樣本量過小，很可能產(chǎn)生偏倚，故需要更多更大樣本量的臨床研究來鑒別多樣化的miRNA在心血管疾病中的特異表達(dá)，為AMI的診斷和預(yù)后提供理想的分子標(biāo)志物，并探索如何通過調(diào)節(jié)miRNA水平來達(dá)到治療的目的。