微小核糖核酸在急性心肌梗死診斷和治療中作用的研究進展

摘要 近年來，隨著分子生物學研究方法的飛速發展，急性心肌梗死（AMI）的機制研究在分子生物學水平取得了長足的進展。研究發現，微小核糖核酸（miRNA）表達異常在AMI發病過程中發揮了重要作用，并可能是AMI早期診斷的標志物以及潛在的治療靶點。本文將重點介紹幾種與AMI發病關系密切的miRNA，并將近年來miRNA作為AMI診斷標志物和治療靶點的研究進展做一綜述。

作者單位：730000 甘肅省蘭州市，蘭州大學第一醫院 心血管內科 甘肅省心血管疾病重點實驗室

作者簡介：唐宇寧 碩士研究生 研究方向為動脈粥樣硬化的基礎與臨床研究 Email:Tangyn.lzu@gmail.com 通訊作者： 張鉦 Email:zhangccu@163.com

微小核糖核酸（miRNA）是一類大小為19～25個堿基的內源性非編碼小RNA分子，研究表明編碼蛋白的基因總數不到3萬個，而非編碼RNA基因約占整個人類基因組的98%，其中編碼的miRNA超過1 000種，負責調控哺乳類動物編碼基因的30% [1]。探討miRNA在人類疾病中作用的研究始于白血病，其后對腫瘤、糖尿病以及免疫系統疾病均有研究。近年來，miRNA在心血管領域尤其是對急性心肌梗死（AMI）調控作用的研究取得了很大進展 [2, 3]。

1 微小核糖核酸在急性心肌梗死發病機制中的作用

miR-1和miR-133主要通過調節細胞凋亡來影響AMI發病過程中心肌細胞的存亡。多項研究表明，這兩種miRNA 在AMI發生后短期內即持續顯著升高。miR-1是一類肌細胞特異性miRNA，過度表達時可通過抑制下游增殖相關靶基因如RasGAP、Cdk9和Rheb的表達，進而抑制心室肌細胞增殖。Xu等 [4]在氧化應激誘導的H9c2大鼠心室肌細胞中發現，miR-1促凋亡而miR-133抑制凋亡。miR-1的靶點為熱休克蛋白（HSP）60和HSP70基因的3'非翻譯區，它能降低HSP60和HSP70蛋白水平，但不改變其轉錄；miR-133在整個Caspase-9基因序列中可能有多個靶位點，在蛋白和信使核糖核酸（mRNA）水平都能抑制Caspase-9的表達，這可能是細胞調節凋亡與存活的機制之一。研究顯示，當心肌細胞處于促凋亡（如缺血和氧化應激）環境時，miR-1水平會病理性升高。

miR-499、miR-208a和miR-208b在不穩定性心絞痛和AMI發生時也顯著增高。miR-499是由β-肌球蛋白重鏈基因Myh7b的19內含子編碼的。基因敲除研究顯示，miR-499和另一個心肌miRNA——miR-208b功能相似，都通過激活緩慢肌纖維基因和抑制快速肌纖維基因來調節肌球蛋白的表達，且兩者均受miR-208a的調節 [5]。轉基因過表達研究發現，miR-499能通過靶向調節親肥大磷酸酶來發揮心肌保護作用 [6]，也能調節早期應激反應基因而使心臟功能障礙 [7]，因此，miR-499在心臟中的功能和它的調節基因表達的后果，目前還不清楚。人類肌肉富含miR-1、miR-133a和miR-499，而miR-208為心肌特異表達的miRNA，且在激素調節的心肌生長中起重要作用。miR-208來自于心肌特異α-主要組織相容性復合體（MHC）基因mRNA前體的第27個內含子。因此，位于內含子中的miRNA與其宿主基因由于來源于同一個轉錄本而有著相似的表達譜。研究者通過基因芯片分析心臟條件性miR-208敲除小鼠模型后發現，miR-208可能通過抑制正常心臟中不表達的快骨骼肌收縮蛋白基因來維持心肌細胞的收縮表型。進一步研究顯示，在應激狀態下，miR-208通過抑制靶基因甲狀腺素受體相關蛋白1的表達從而調控心肌肥厚、纖維化以及β-MHC的表達。因此，α-MHC不僅僅只是心肌收縮蛋白，它還包括一個能夠調控激素刺激的心肌生長和基因表達的miRNA。

作為miRNA中的一員，Let-7g能夠調節轉化生長因子-β （TGF-β）來對內皮細胞發揮保護性作用，同時可以抑制內皮細胞和平滑肌細胞攝取氧化型低密度脂蛋白，進而抑制動脈粥樣硬化（AS）的發展。在體外實驗中，Let-7g能抑制內皮細胞炎癥，并通過下調TGF-β來抑制纖溶酶原激活抑制劑-1 （PAI-1）的表達，同時可增加同源基因的表達來降低內皮細胞的敏感性；在活體內，給高血脂的載脂蛋白E基因敲除小鼠注射Let-7g抑制劑會增加TGF-β誘導的基因（包括PAI-1基因）在血管內的表達，增強巨噬細胞在頸動脈的滲透性，并導致頸動脈內膜中層增厚；腔隙性腦卒中患者的血清Let-7g低水平與血漿PAI-1高水平有關。由此推論，Let-7g可能是內皮細胞炎癥的關鍵內生抑制劑，當缺乏Let-7g時，內皮細胞獲得促炎性表型，引發血管損傷并激活血小板 [8]。

2 微小核糖核酸在急性心肌梗死診斷中的作用

血清miRNA被認為是一種理想的診斷標記物，因其與血漿中的囊泡、高密度脂蛋白膽固醇、Ago2蛋白以及核仁磷酸蛋白1等形成復合物，或存在于凋亡小體中而十分穩定，能承受住反復的凍結—融解循環，并能抵抗核糖核酸酶的降解 [9]，且血漿中miRNA水平不受臨床相關因素的影響，如年齡、性別、體重指數、腎功能、收縮壓以及白細胞計數等。此外，血清miRNA具備標志物的大多數特點：無創檢測、高敏感度和特異度、病變早期即可檢測到、隨病變程度有時間性的改變、半衰期長且檢測迅速等。

Liebetrau等 [10]對肥厚型梗阻性心肌病患者采用經冠狀動脈的室間隔肥厚消融術，得到了冠狀動脈閉塞后循環中特定miRNA的出現時間。在冠狀動脈閉塞后僅僅15 min，miR-1和miR-133濃度就開始上升，且在74 min達到平臺期，這可能能為非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）的早期識別作出貢獻。Wang等 [11]用反轉錄—多聚酶鏈式反應檢測了AMI患者在發作24 h和6 d后的全血和血漿中miR-133和miR-328水平，發現這兩種miRNA在AMI患者血漿中的水平均顯著高于正常對照組人群。另一研究發現，STEMI患者體內miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-499-5p會迅速上調，其中miR-133a最顯著，與對照組相比升高了140倍 [12]。 有研究表明，miR-133a在STEMI患者體內濃度升高與大面積心肌梗死、心肌再灌注損傷以及心肌挽救減少有關 [13]。miR-1、miR-133a和miR-133b升高和達峰時間與心肌肌鈣蛋白I同步，miR-499-5p則稍微滯后，在發病第5 d時miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-499-5p和miR-375都恢復到正常水平，而miR-122直至第30 d仍未恢復 [14]。

miR-1、miR-133a和miR-208a能在AMI發生4 h內持續性升高，在心肌肌鈣蛋白T前達到高峰，先于傳統標志物。miR-208a尤其適合作為標志物，因為它是心臟特異的，在健康人群和非AMI患者血漿中為陰性，而在AMI患者中檢出率高達90.9%，而miR-1、miR-133a、miR-133b、miR-208b和miR-499在不穩定性心絞痛和AMI患者中均可檢測到。在冠狀動脈閉塞1 h后，miR-208a即顯著升高并可檢出 [15]。因此，miR-208a對AMI的診斷具有較高的敏感性和特異性。此外，有研究者比較了NSTEMI老年患者和急性心力衰竭但不伴有AMI的老年患者血漿中miRNA水平，結果發現，NSTEMI患者血漿中miR-1、miR-21和miR-133a顯著高于正常對照人群，且 miR-21和miR-499-5p水平顯著高于急性心力衰竭組，其診斷的精確性高于高敏心肌肌鈣蛋白T。

Vogel等 [16]研究了全基因組miRNA的動力學改變，發現有多種miRNA可能是AMI的標志物，提示我們或可用一組miRNA來作為AMI診斷標志物，如聯合檢測miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-208a，以提高準確性。未來需要更多的研究來確定哪些miRNA在早期診斷方面可優于肌鈣蛋白，尤其是在肌鈣蛋白邊界性升高、心電圖改變和癥狀不典型的患者，以及AMI的排除診斷。然而，miRNA的靶作用具有多效性，它的特異性到底能否優于高敏心肌肌鈣蛋白，目前還未可知。用外周血miRNA作診斷標志物還有許多問題亟待解決，如抗凝藥和抗血小板藥物對miRNA的干擾；此外，miRNA在血清、血漿和全血中均穩定存在，但在RNA分離和多聚酶鏈式反應定量分析中會逐漸減少，有學者認為血清可能是最適樣本，因為血清可以避免白細胞導致的偏倚；另一個重要的問題是，miRNA的檢測技術需要標準化，有研究用miR-17來標化樣本 [12]，然而另有研究表明miR-17在急性冠狀動脈綜合征患者體內也有升高 [17]，且已知miR-17-92簇受局部缺血和炎癥因子的調節，因此miR-17用于標化的準確性也有待商榷。此外，多聚酶鏈式反應技術也是限制miRNA應用的一個重要方面，miRNA序列的擴增依靠寡核苷酸，然而擴增時如果滴定不當可能導致偽影，數字多聚酶鏈式反應能相對提高miRNA定量的精確度。最后，以目前的技術水平，miRNA的分離以及隨后的反轉錄—多聚酶鏈式反應定量仍需大量時間，要使miRNA廣泛用于臨床，需迅速有效得出結果，即最好能在床旁檢測。

關于miRNA能否作為AMI的預后指標，目前知之甚少。有研究檢測了AMI患者的6種肌肉中富集的miRNA，發現與穩定性心絞痛患者相比，AMI患者的miR-1、miR-133a 和miR-208b水平顯著升高；單因素分析揭示，miR-133a和miR-208b水平與死亡風險顯著相關 [18]。但是，經高敏心肌肌鈣蛋白T調整后并未發現獨立的預后意義。

3 微小核糖核酸在急性心肌梗死治療中的作用

心臟miRNA能夠影響細胞死亡、心肌電生理功能、心肌原始細胞增殖和分化、血管生成以及細胞外基質成分，因此，針對miRNA的治療能夠為改變AMI的病理生理過程提供機會。以miRNA 為靶點設計藥物，補充表達下調的miRNA 或抑制過多表達的miRNA，將可能有效阻止AS的進展，同時也為AMI治療帶來新希望。如前文中提到的，既然Let-7g能抑制內皮細胞炎癥，Let-7g類似物很可能對AS發揮治療作用。此外，在載脂蛋白E敲除的小鼠體內，miR-181b能抑制炎癥和AS，miR-146也可抑制內皮炎癥激活，故而補充miR-181b或miR-146也可能起到抑制AS的作用。miR-1促凋亡而miR-133抑制凋亡，這提示miR-1和miR-133的相對水平比絕對水平更重要：升高miR-1和（或）降低miR-133水平有利于細胞凋亡，減少miR-1和（或）增高miR-133水平有利于存活 [4]，調節miR-1與miR-133的相對水平，也可起到提高心肌細胞存活率的作用。

miRNA在治療方面的探索主要通過過表達和抑制途徑,使用病毒載體生產miRNA以及寡核苷酸miRNA類似物的研究仍在進行。與之相比，用反轉錄方法來抑制基因表達的研究更為成熟：通過化學修飾作用，提高miRNA拮抗劑（反義寡核苷酸）與miRNA的親和力，并獲得核酸酶抵抗性、蛋白結合能力（硫代磷酸酯主鏈連接）和細胞攝取能力（2'-O-甲基-膽固醇-共軛）。鎖核酸是8個或15個堿基的反義分子，具有2'修飾的糖基（2'-氟和2'-O-甲氧基乙基），使其對靶序列的親和力明顯升高。但有報道提出，鎖核酸能誘導補體級聯反應、激活固有免疫并有肝毒性 [19]。

由于miRNA靶作用的多效性，它們對人體的調節作用是不可預估的，還有諸如miRNA類似物的精確調節、根據不同個體危險因素的miRNA拮抗劑的生產等多個問題并未解決，對其進一步研究將豐富我們對心血管生理和疾病的認識，并推動和拓展心血管疾病的治療思路和方法。

4 小結與展望

miRNA在AMI發生過程中發揮重要作用，但尚需更多研究來深入探討miRNA的作用范圍、對miRNA活性的干預措施的安全性，以及這些基礎研究在具體疾病中的實際應用價值。同時，由于目前臨床研究中所納入研究樣本量過小，很可能產生偏倚，故需要更多更大樣本量的臨床研究來鑒別多樣化的miRNA在心血管疾病中的特異表達，為AMI的診斷和預后提供理想的分子標志物，并探索如何通過調節miRNA水平來達到治療的目的。