瓣膜內皮細胞在鈣化性主動脈瓣疾病發病過程中的作用研究現狀

摘要 心臟瓣膜病是一類重要的心臟疾病，其發病病因近半個世紀發生了很大的變化。目前退行性瓣膜病的發病率逐漸升高，鈣化性主動脈瓣疾病是退行性瓣膜病的最重要的表現之一。瓣膜內皮是瓣膜組織中直接接觸血流的細胞，在瓣膜疾病的發病過程中扮演重要的角色。血流剪切力作用于瓣膜內皮細胞，使其形態、基因表達發生相應地變化，導致瓣膜內皮細胞發生上皮-間質轉換，成為具有增殖能力的瓣膜間質細胞，或者使瓣膜內皮細胞的旁分泌機制發生變化，影響瓣膜間質細胞的功能，從而導致瓣膜病的發生。

基金項目：北京協和醫學院博士生創新基金（2013-1002-47）

作者單位：100037 北京市，北京協和醫學院 中國醫學科學院 國家心血管病中心 阜外醫院 心外科

作者簡介：劉漢凝 博士研究生 主要從事心血管外科的基礎與臨床研究 Email：fuwailhn@hotmail.com 通訊作者：鄭哲 Email：zhengzhe@fuwai.com *為共同第一作者

心臟瓣膜疾病是一類常見的心臟疾病，主要表現為心臟瓣膜的狹窄或關閉不全以及由此引起的血流動力學改變而造成的心臟、肺血管等器官的病變。在美國，瓣膜性心臟病的患病率達2.5% [1]。瓣膜性心臟病主要包括先天性瓣膜病和獲得性瓣膜病（成人瓣膜病）。成人瓣膜病根據病因不同，主要分為風濕性瓣膜病和退行性瓣膜病。流行病學研究表明，上世紀50年代以前，在全球范圍內成人瓣膜病以風濕性瓣膜病為主；50年代以后，成人瓣膜病的病因出現了明顯的地區差異 [2]。在發達國家，隨著衛生條件的改善和抗生素的廣泛應用，風濕性瓣膜病的數量逐漸減少，而退行性瓣膜病成為成人瓣膜病的主要病因。有調查顯示，歐洲地區的瓣膜病患者中，有63%是退行性瓣膜病，22%是風濕性瓣膜病 [3]。在發展中國家，風濕性瓣膜病發病率仍然較高。在亞洲地區，每年約有35～50萬人死于風濕性瓣膜病 [4]。據《中國心血管病報告2012》，我國風濕性心臟病患者數量高達250萬人 [5]。而隨著人口老齡化的加劇和生活及衛生條件的進一步改善，發展中國家尤其是我國成人瓣膜病的主要病因也逐步由風濕性轉為退行性。

退行性瓣膜病是一類由于結締組織形態變化引起瓣膜結構改變，進而導致瓣膜及其附屬結構正常功能受損的非感染性瓣膜疾病，主要表現為主動脈瓣的增厚和鈣化。過去認為，退行性瓣膜病是一種與年齡相關的退行性病變，近年來，越來越多的研究表明，退行性主動脈瓣疾病是一個主動的病理生理過程，包括慢性炎癥、脂質沉積以及鈣化等一系列的改變 [6]。所以，近年來更傾向于將“退行性主動脈瓣疾病”稱為“鈣化性主動脈瓣疾病”。國內學者報道目前我國老年人群中，瓣膜鈣化的超聲檢出率為8.1%～48.5% [7-9]。一項對社區老年人鈣化性瓣膜病五年的縱向研究結果表明，2011年60歲以上老年人鈣化性瓣膜病為15.6%，較2005年的13.4%有明顯上升 [10]。目前，瓣膜病的治療主要依賴于外科修復和置換，治療成本高，由此帶來的社會經濟負擔大。探索瓣膜病的發病機制，進一步尋求對因治療策略已經成為瓣膜病防治研究的熱點。

心臟瓣膜組織由瓣膜內皮細胞（VECs）和瓣膜間質細胞（VICs）以及細胞外基質組成。VECs是覆蓋在瓣膜表面的單層內皮細胞，通過調節滲透、炎癥以及防止血栓形成保護瓣膜內部的組織結構 [11]。VECs在瓣膜表面，能夠直接接觸到血液，循環中的血流動力學以及血液的生化改變能夠直接作用于VECs，外界的種種變化通過VECs感受并引起相應的變化，這樣的過程可能在鈣化性主動脈瓣疾病的發生、發展過程中起到重要的作用 [12]。

1 血流動力學變化對主動脈瓣內皮細胞的影響

首先，從組織學的角度來講，主動脈瓣組織的結構本身是對血流動力學的一種主動的適應。主動脈瓣的細胞外基質可以分為三層，分別是位于主動脈側的纖維層、位于左心室側的彈力蛋白層和二者之間的疏松層。三層的分布以及組織結構很好地適應了血流動力的需要。在收縮期，血流由左心室流向主動脈，血流的剪切力作用于主動脈瓣的心室側，心室側的彈力蛋白被拉伸，而主動脈側的纖維收縮，使主動脈側皺縮，瓣膜開放；而在舒張期，心室側的血流剪切力減弱，血液作用于主動脈側，心室側彈力蛋白回縮，主動脈側的纖維回復，主動脈瓣關閉。在整個過程中，位于中間的疏松層起到對血液剪切力以及其引起的瓣膜相對運動的緩沖作用，并且其內的親水性的氨基聚糖能夠穩定地吸收水分，保證瓣膜組織能夠抵抗滲透壓而不會腫脹 [13]。

而從另一方面，血流動力學也作用于主動脈瓣組織，使其被動地適應血流動力學變化。受血流動力學影響最直接最明顯的是瓣膜內皮細胞。

首先，血流引起的剪切力是實現瓣膜內皮細胞功能重要刺激。內皮細胞對血流剪切力的敏感性表現在許多方面，其中最直接的是形態學的變化。在血管中，內皮細胞能夠順著血流方向延長平行排列，而在血流分叉處，內皮細胞卻表現為多邊形或者圓形 [14-16]。在主動脈瓣的發育過程中，瓣膜內皮細胞也存在類似的現象 [17]；然而在出生后的成熟瓣膜中，有部分區域的內皮細胞的延伸方向與血流方向相垂直，對這種現象可能的解釋是因為存在于瓣膜內皮細胞下的膠原纖維以圓周狀分布，其對瓣膜內皮細胞的接觸作用造成了這樣的形態學變化 [18]。有趣的是，肌動蛋白始終能夠將任何形態的瓣膜內皮細胞向血流方向拉伸 [19]。另外，最近的研究表明，體外培養的人主動脈瓣內皮細胞能夠平行于血流方向排列 [20]。總之，盡管在形態上，瓣膜內皮細胞與血管內皮細胞具有差異，但是能夠依血流方向排列是這兩類內皮細胞的共同特點。

其次，不同的血流動力學的變化可能也會導致主動脈瓣兩側的內皮細胞基因表達差異。轉錄組學的研究告訴我們，主動脈側更容易發生纖維化以及鈣化，而抗氧化可以使其免于這種病理變化。在高脂飲食飼養兩周誘導的早期主動脈疾病豬模型中，研究者們在更容易患病的主動脈側瓣膜發現了保護性的內皮細胞表型 [21]。體外研究表明，與瓣膜病發病有聯系的氧化、炎癥以及成軟骨相關的基因在層流的剪切力作用下表達降低 [22]。另外有研究表明，在紊亂的剪切力作用下，炎癥相關的基因，包括血管細胞黏附分子-1 （VCAM-1）、細胞間黏附分子-1 （ICAM-1）、骨成型蛋白-4 （BMP-4）以及轉化生長因子-β1 （TGF-β1）表達升高。但是這種升高僅僅出現在主動脈側的瓣膜內皮細胞，表明主動脈側對于剪切力更為敏感，而這種敏感可能與疾病相關 [23]。

2 主動脈瓣內皮細胞對瓣膜間質細胞的調控

主動脈瓣疾病進程中出現的一系列變化包括心肌細胞外基質（ECM）的重構、鈣化等很大程度上都是通過瓣膜間質細胞調控的。而血流動力對瓣膜的作用可能通過瓣膜內皮細胞向間質細胞傳遞從而實現對瓣膜間質細胞的調控 [12]。Butcher 等 [22]研究表明，在體外共培養VICs與VECs時，當VECs處于具有流體剪切力的情況下，VIC中成肌纖維細胞標記物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達明顯降低。這說明，流體剪切力確實通過VECs對VICs實現了調控。VECs對于VICs的調控很可能是通過旁分泌實現的，目前的研究認為，VECs調控VICs旁分泌的因子主要有一氧化氮（NO）和C型尿鈉肽（CNP）。流體剪切力會使內皮細胞中NO合成酶mRNA的表達升高 [24]，而在體外，NO可以防止VIC收縮介導的鈣化小結形成 [25]。CNP具有和NO相似的作用，即能夠誘導環磷酸鳥苷（cGMP）的產生 [26]。CNP在表達在正常主動脈瓣組織，尤其是在心室側的內皮細胞中高表達 [27]。而在體外培養時，CNP能夠阻止VICs分化為成肌纖維細胞和成骨細胞，表明CNP在維持主動脈瓣正常功能中具有重要作用 [28]。而在狹窄的人主動脈瓣中，CNP的表達會明顯降低 [29]。

3 主動脈瓣內皮細胞向間質細胞轉換在瓣膜疾病中的作用

上皮細胞向間質細胞轉化（EMT）是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。EMT現象在胚胎發育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉移和多種纖維化疾病中具有重要作用。心臟在胚胎發育過程中，經歷兩次EMT形成原始心臟，此后，在房室交界處和心室流出道的位置又通過EMT形成原始瓣膜。對于脊椎動物，心內膜墊（Endocardial cushion）的形成是瓣膜發育的開始 [30]。來自心肌層等的信號因子啟動鄰近心內膜的內皮細胞發生EMT [31]，這些細胞通過EMT轉化為間質祖細胞，間質祖細胞具有高度增殖的能力，它們可以進一步形成瓣膜間質細胞（VICs） [32]。間質祖細胞與心內膜墊的ECM形成瓣膜原基。此后，瓣膜原基在各種信號通路的調控下，瓣葉部分逐漸變薄變長。在此過程中，間質祖細胞分化為VICs而喪失增殖能力，成熟的VICs基本不具有增殖能力 [32]；同時ECM也發生重建，形成三層結構，分別富含彈力蛋白、膠原纖維和蛋白多糖 [33]。通過這樣的一系列變化，心臟瓣膜逐漸發育成熟。

近年的研究表明，許多成人心臟疾病的發生都與胚胎發育過程的生理現象重新激活有著重要的關系。越來越多的研究認為，心臟瓣膜疾病的發病機理也與胚胎期發育相關信號通路的激活有關 [34-36]。Paruchuri等 [37]的研究發現，成年人瓣膜中同時表達CD31（內皮細胞標記物）和α-SMA（間質細胞標記物）的細胞，即發生EMT的細胞數量約為胚胎發育14-19周時期的十分之一。在對缺血性二尖瓣反流患者的瓣膜研究中發現，患者的二尖瓣瓣葉面積明顯增大，Chaput等 [38]認為這種病理改變是因為二尖瓣瓣葉的代償并以此減少二尖瓣的反流。Dal-Bianco等 [39]進一步通過機械損傷綿羊瓣膜模型模擬缺血性二尖瓣反流患者的病理變化，并發現處理組增厚的二尖瓣內皮細胞發生EMT的數量高出對照組4倍。另外，研究者還在4例缺血性二尖瓣反流患者的瓣膜的上皮細胞層發現了α-SMA陽性的細胞。首次證實了在人瓣膜病組織標本中同樣存在EMT的激活。這些證據表明，在二尖瓣增厚增大的病理改變過程中，EMT的重新激活是一個重要的病理變化。在鈣化性主動脈瓣疾病中，在瓣膜的主動脈側具有共表達CD31與α-SMA的發生EMT的細胞，而作為對照的兒童主動脈瓣沒有發生EMT的細胞 [40]。

4 結語

鈣化性主動脈瓣疾病已經并且越來越成為威脅人類身體健康的心臟疾病，探索此類疾病的病因對于尋找更加有效的治療策略具有重要的意義。瓣膜內皮細胞作為聯系外界因素與瓣膜間質的重要橋梁，在發病過程中扮演重要角色。VECs接受血流動力學變化的刺激，一方面自身可能發生改變，激活向間質轉換的能力；另一方面，其旁分泌的物質可能發生變化，從而調控瓣膜間質細胞的病理過程。對VECs更進一步的研究重點應該集中在EMT、旁分泌以及血流動力因素對VECs的調控這幾個方面。對于VECs發生EMT的機制以及EMT在疾病進程中的作用、更多旁分泌因子的發現以及調控通路的研究和如何減少血流動力變化對VECs的影響將給瓣膜病病因與新的治療手段的探索帶來更多的啟示。