卵黃抗體在國內外醫藥方面的研究現狀

王新穎，周鶴峰，邵 敏

卵黃抗體在國內外醫藥方面的研究現狀

王新穎，周鶴峰，邵 敏

本文闡述卵黃抗體的優勢性質和結構特點，概述卵黃抗體在抗人獸共患病、診斷應用、抗蛇毒類生物制品和抗生育制品等方面的研制與應用。

卵黃抗體；優勢性質；人畜共患病；生物制品

抗體在疾病的診斷、免疫防治和其它基礎研究中一直發揮著重要的作用，人工制備方式是大量獲取抗體的有效途徑。根據過去的研究發現，傳統的多克隆抗體有一些無法避免的缺點，比如：不易大量生產，特異性不高，易發生交叉反應，違反動物福利相關政策等，從而應用受限。目前研究的單克隆抗體可以克服特異性不高的缺點，但是由于不能發生沉淀和凝集反應，并且制備繁雜，價格較高，因此其應用范圍也不大，高成本的投入限制了通過哺乳動物生產大規模的抗體。卵黃抗體(Egg yolk Immunoglobulin，IgY)是指利用免疫禽類的方式，從其生產的蛋的卵黃中提取相應的特異性抗體。卵黃抗體具有許多獨特的優勢，比如：制備成本低、產量高、可制成經濟型口服免疫球蛋白、對實驗動物的傷害性降低，實驗過程中蛋黃的易收獲性等優點。

目前，IgY被認為是一種可靠的具有經濟效益的抗生素替代品，用于對抗多種病原體,如細菌、病毒和寄生蟲[1]。IgY具有不與人類補體以及類風濕因子結合等免疫學特性，現在己被廣泛用于免疫學診斷和醫藥等許多方面[2]。本文從IgY抗人畜共患病、診斷應用、抗蛇毒類生物制品和抗生育方面對IgY的研究現狀進行了綜述。

1 卵黃抗體的優勢性質

IgY具有化學性質穩定、對于動物福利政策的提倡、制備成本低、產量高、可制作口服免疫球蛋白、制備提取純化過程簡單、純度較高、相對于哺乳動物抗體交叉反應少和實驗動物來源廣泛等優點[1-3]。血清抗體在母雞體內形成過程中，由于其具有繼續合成和轉移能力，濃度可以保持平衡穩定[4]。IgY的另外一個突出的優點是所謂的進化距離，由于發育的進化距離導致哺乳動物和雞存在抗體特異性的差異。雞產生的抗體相比于系統發育高度保守的哺乳動物產生的抗體在對抗蛋白質和肽方面往往更有效[5]。

與兔IgG的比較可以看出[6]，抗體的采集方式，兔IgG的采集方式對動物有傷害性而卵黃抗體IgY可以降低對動物的傷害；兔IgG的平均產量是每毫升血液可以提取5 mg免疫球蛋白，每月平均可以獲得200 mg免疫球蛋白，而IgY的產量為平均每個蛋50-100 mg，平均每月1000-2800 mg；兔IgG在pH 3-10,70℃條件下性狀穩定，IgY在pH 4-9,65 ℃下性狀穩定；兔IgG的胃蛋白酶穩定性強于IgY，但是兔IgG的胰蛋白酶穩定性弱于IgY[4，6]。IgY等電點(pI)的范圍在5.7-7.6，而哺乳多克隆抗體等電點范圍為6.1-8.5之間[7]。

2 卵黃抗體IgY的結構

前人認為IgY是一種和哺乳動物抗體IgG類似的免疫球蛋白，目前研究發現IgY是哺乳動物IgG、IgE和IgA的進化祖先[7-8]。X射線晶體衍射結構分析表明，目前發現的免疫球蛋白都是由四肽鏈分子組成，由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，它們的重鏈的分子量大約50-70 kDa，有450-550個氨基酸，輕鏈的分子量大約為25 kDa，有214個氨基酸殘基[4]。盡管IgY功能和哺乳動物IgG是等效的，但在結構方面卻有一定差異，哺乳動物IgG輕鏈包含一個可變區和一個恒定區，重鏈包含一個可變區和三個恒定區，卵黃抗體IgY輕鏈包含有一個可變區一個恒定區，重鏈則擁有一個可變區和四個恒定區[8]。IgY的分子量是180 kDa，哺乳動物IgG的分子量為150 kDa，IgY的重鏈分子量是(67-70) kDa，哺乳動物IgG的重鏈分子量是50 kDa的重鏈分子量[7]。與哺乳動物的IgG相比，IgY抗體的鉸鏈區的靈活性、擺動性和柔韌性較差，同時也導致了Fab部分的柔韌性也相應降低，IgY相比于IgG是一個更具疏水性的分子[6]- [8]。

IgY的結構特異性源自于其分子結構，在雞中，抗體IgY 的多樣性主要是通過基因轉換來實現，從大量的假基因轉移至表達位點，通過V-J靈活性的連接而成，以保證多樣性，所以基因轉換導致了雞抗體的多樣性[9]。

3 卵黃抗體IgY在醫藥領域的應用

3.1 人畜共患病預防和治療方面

Jenn-Fa Liou等研究表明[10]，通過使用滅活的人腸病毒71型(EV71)作為抗原肌肉注射白來航雞進行免疫，該實驗目的是對IgY的被動防護進行評估，通過酶聯免疫吸附法(ELISA)測定IgY的抗體活性和特異性。腸病毒71型特異性卵黃抗體應用于感染腸病毒71型的模型小鼠，結果表明，腸病毒71型特異性IgY無論是腹腔注射或口服給藥都能顯著減少感染腸病毒71型小鼠發病率和死亡率。

爆發性非細菌性急性胃腸炎90%以上是由諾如病毒( NoVs )感染所致，目前市面上沒有可用的疫苗或抗病毒藥物用來預防和治療由NoVs所導致的疾病。Ying-Chun Dai等研究表明[11]，IgY通過被動免疫接種諾如病毒NoVs后產生大規模抗 NoVs抗體，50 ug NoVs病毒P顆粒抗原肌肉注射20周齡健康的白來航雞三次，兩個星期作為時間間隔，從首次免疫至第三次免疫后卵黃中的特異性IgY持續增加。通過中和試驗表明，特異性IgY可以實現對抗由NoVs病毒感染疾病的預防和治療。

流感是最為常見的急性病毒性疾病，并且會造成不同程度的全身性疾病，比如：輕度疲勞、呼吸衰竭和死亡。Junlin Wen等研究表明[12]，通過使用滅活后的B型流感病毒(IBV)免疫母雞，用聚乙二醇6000提取分離卵黃中的IgY，通過ELISA測定IgY的抗體滴度，從第二周開始滴度慢慢增加到第五周到達峰值。通過特異性IgY抗流感病毒感染的動物模型，結果表明，感染B型流感病毒的模型小鼠肺部的病毒滴度顯著下降。

弧菌被確認為人類病原體，其中有8種副溶血性弧菌是通過海鮮傳染疾病造成嚴重的腸道疾病，Kassima等[13]研究探討IgY對抗海鮮傳播疾病中的2種弧菌病原體的抑制效果。肌肉注射免疫接種在四個不同位點，IgY抗體滴度在第四周達到峰值。結果表明，IgY對副溶血性弧菌和創傷弧菌有顯著抑制作用無論在液體介質中還是在被弧菌感染的小鼠模型中，特異性IgY在體外和體內發揮著重要的抗菌作用，IgY可以用于研制針對弧菌的抗生素或口服免疫治療劑。

厭氧細菌牙齦卟啉菌是牙周炎的主要致病菌主要通過與一些口腔細菌形成牙菌斑造成牙周疾病。Susumu Hamajima等研究表明[14]，通過使用克隆的40 kDa的外膜蛋白(是牙齦的重要聚集因子)作為抗原肌肉注射免疫母雞，從蛋黃中得到高度純化的IgY，結果表明，純化的IgY抗體可特異性識別40 kDa的外膜蛋白，純化后的IgY可顯著抑制戈登鏈球菌，可用于被動免疫接種，并且可有效對抗牙齦感染的牙周疾病。

齊靜姣等研究表明[15]，旋毛蟲病(trichinellosis)是一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，用可溶性旋毛蟲肌幼蟲抗原與福氏完全佐劑充分乳化后皮下注射免疫育齡種雞，于雞雙翅及背部皮下多點注射，再經水稀釋法初步純化濃縮后獲得高效價的特異性IgY，通過免疫雞可成功誘導出高效價的抗旋毛蟲抗體，為旋毛蟲病感染的防治和治療探索了新的方法和途徑。JJ Xu等研究表明[16]，通過口服5種艾美耳球蟲活卵囊免疫母雞六次，用ELISA測定血清和卵黃抗體效價，結果表明IgY的平均產量為9.2mg/ml，新孵出的雛雞可表達艾美耳球蟲特異性IgY抗體，該抗體可以預防雞球蟲病。

3.2 診斷應用方面 近年來卵黃抗體被成功地應用于免疫檢測和診斷。趙文思等研究表明[17]，將純化后的HIV-1 p15(gag)蛋白與完全弗氏佐劑作為抗原等體積混勻均勻并乳化后免疫母雞，用水稀釋法進行提取特異性IgY，通過ELISA等技術檢測抗體的特異性，結果獲得了具有較高純度的特異性IgY，特異性IgY能夠與HIV-1蛋白P15特異性結合，在HIV-l gag的診斷檢測方面提供了新的思路，為研制抗HIV-lpl5卵黃抗體IgY的大量生產奠定了實驗基礎。

艱難梭菌相關性腹瀉(CDAD)已經成為醫院內腹瀉的主要原因，艱難梭菌的毒素A蛋白是 CDAD的主要致病因素。郭桂萍等研究表明[18]，純化合成艱難梭菌毒素A重組質粒，將目的蛋白作為抗原與弗氏佐劑按照1∶1體積比混合，采取胸肌和頸部皮下多點注射，劑量為1 ml,免疫4次，時間間隔為2周。結果顯示，制備出針對艱難梭菌毒素A的C端結構域的卵黃抗體，卵黃抗體經純化后純度約90%，可用于艱難梭菌相關性腹瀉的診斷和治療，為利用IgY進行艱難梭菌相關性腹瀉CDAD的診斷和治療打下了基礎。

3.3 抗蛇毒類生物制品方面 臨床上使用的抗蛇毒血清是通過免疫馬而制得相應抗體，但是使用的抗毒素馬血清效價不高、相對分子質量大、價格昂貴等缺點。相比于每公斤馬平均生產10 ml血清，使用IgY抗蛇毒血清用于治療家養動物是最便宜的替代品。研究表明[19]，用20 mg的非洲蛇毒液肌肉注射免疫母雞，在雞乳房區域采用兩個或三個不同位點進行注射，以3周作為時間間隔，以免疫前的雞蛋作為陰性對照，應用水稀釋法進行提取，結果表明，第一次免疫后抗非洲蛇毒IgY抗體滴度顯著增加，在第9周達到最高峰，具有較高的抗蛇毒血清酶活性， IgY抗蛇毒血清的療效好，安全性高。

3.4 抗生育制品方面 精子具有免疫原性，相應的特異性抗體與精子抗原特異性結合后可通過抑制精子的運動能力等原因而導致不孕，使人們能夠用精子制成抗原去免疫機體，使其產生相應的抗體，從而研制并開發避孕藥的潛在的可能性。研究報道，用人全精子抗原來免疫產蛋母雞[20]，從卵黃中獲得了大量特異性的抗人精子IgY，結果發現這些抗精子IgY可以使精子凝集，使抗精子IgY有可能成為未來極有潛力的候選避孕藥具。

趙萬樂等研究表明[21]，用處理后的奶牛Y精子與完全佐劑1∶1混合后作為抗原在母雞胸肌上采用不同的5點進行肌肉注射，采用水稀釋法提取抗體，進行凝集試驗和測定抗體含量、得率和效價，結果顯示，卵黃中含 有與奶牛Y精子作用的有效抗體IgY，并且能使精子發生凝集現象，但是IgY對其作用的專一性還有待研究。

4 結 語

綜上所述，IgY具有制備成本低、產量高、可實現大批量規模生產，可制成經濟型口服免疫球蛋白，且對實驗動物的傷害性可降到最低。隨著卵黃抗體的發展，應用于疾病的防治、檢測和治療方面也越來越廣泛，并且IgY也正在向保健品和功能性食品等方面發展。但是目前IgY在國內的研究應用還處于初步階段，主要的原因是：對于IgY沒有統一的質量標準作為參考；沒有出臺統一的質量監控標準；實驗用動物沒有標準化只是市面的商業用家禽。

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Research status of yolk antibody in medicine application in Chinese and foreign studies

WANG Xin-ying,ZHOU He-feng,SHAO Min

(DepartmentofBioengineering,ZhuhaiCampus,ZunyiMedicalCollege,Zhuhai519041,China)

In this paper, we systematically describe the advantages of the nature and structural characteristics of yolk antibody. Meanwhile, we reviewed research status and application of yolk antibody in China and foreign on aspects of medicine. Comprehensive overview for the development and application of anti-zoonotic disease, diagnostic applications, anti-snake venom and anti-fertility products were discussed.

yolk antibody; advantage of nature; zoonoses; biological products

Shao Min, Email: sm780909@163.com

貴州省科技廳基金項目(黔科合SY字(2012)3091)和2010年遵義醫學院青年科研啟動基金資助

邵敏，Email:sm780909@163.com

遵義醫學院珠海校區生物工程系，珠海 519041

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.018

R392.11

A

1002-2694(2015)02-0179-04

2014-07-14；

2014-10-25

Supported by the Guizhou Province Science and Technology Department Fund (Guizhou Branch of SY Word (2012) 3091), and the 2010 Zunyi Medical Youth Scientific Research Foundation