納米材料對胎盤屏障功能毒性作用的研究進展

摘要:納米材料因其粒徑小和比表面積大等獨特理化性質而被廣泛應用于物理、化學、生物和醫學等各個領域，其對人體及環境可能造成的潛在危害也愈發受到人們的重視，其中納米材料孕期暴露對后代發育的影響更是備受關注。近年來，數種常見納米氧化物、碳納米材料、量子點及金屬納米材料對胎盤屏障毒性作用的相關研究發現，多數納米材料能夠穿過胎盤屏障并破壞胎盤正常結構，甚至影響子代的生長發育及性成熟，其毒性程度常與納米材料尺寸、包被材料、劑量和暴露方式相關。納米材料的胎盤屏障毒性作用機制研究也取得進展，期望能有更為科學完善的體系以對納米材料毒性進行全面評價。

文獻標志碼: A

文章編號: 1000-3002(2015)03-0498-05

DOI: 10．3867/j．issn．1000-3002．2015．03．025

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81201691);江西省科技廳青年科學家(井岡之星)培養對象項目(20142BCB23004);南昌大學分析測試中心基金資助項目(2012018);江西省自然基金重大項目(20143ACB21003)

作者簡介:張婉怡(1991－)，女，碩士研究生，主要從事婦產科學及納米材料生殖毒性研究。

通訊作者:傅　芬，E-mail: fu_fen@163．com，Tel:(0791)86331753

納米材料被廣泛應用于物理、化學、生物和醫學等各個領域。納米材料和蛋白質同級別的尺寸大小使其在藥物靶向運輸和熒光生物標記等方面擁有廣泛的應用前景 ［1］，部分無機納米材料也因其抗菌特性而被應用于新型織物的開發 ［2］。然而，在生產和使用過程中，納米材料通過多種途徑釋放到環境、水源和食品供應鏈中并暴露于人群 ［3］。因此，納米材料的潛在毒性作用日漸受到重視。生殖毒性因直接關系物種繁衍，是納米毒理學研究的重要內容。

納米材料的生殖毒性研究主要包括對生殖能力、胚胎發育期對胎兒的致畸作用和圍生期對子代的影響等方面。其中胚胎發育時期(尤其是胚胎發育早期)是哺乳動物最敏感時期，妊娠母體在該階段接觸藥物或化學材料可能會對子代造成不同程度的影響。胎盤作為母體和胎兒間的生理連接，在妊娠期控制母體循環系統與胎兒循環系統之間的物質流通，在調節胎兒營養代謝的同時阻止部分病原體或大分子化合物進入胎兒體內，因而又稱為胎盤屏障。胚胎的正常發育離不開胎盤的正常生長，而胎盤的結構功能受損也成為流產、胎兒生長受限和妊娠期高血壓等妊娠并發癥產生的重要原因之一 ［4］。胎盤屏障作為決定納米材料對胚胎影響程度的關鍵因素，是研究納米材料生殖毒性的主要對象。

在研究納米材料對胎盤屏障毒性作用時，除了對子代發育情況的評估外，胎盤本身的結構變化也可反映納米材料的毒性。常選擇與人胎盤類型同為血性絨毛膜型的嚙齒類動物胎盤作為模型。人胎盤由羊膜、葉狀絨毛膜(也稱叢密絨毛膜)和底蛻膜構成，每個絨毛葉都充滿胎兒血管，直接浸潤在母血中。而嚙齒動物胎盤由蛻膜層、交界區和迷路區組成，交界區內又包含海綿絲細胞及滋養層巨細胞，母體的子宮螺旋動脈匯聚成血管叢，從滋養巨細胞的間隙穿過海綿絲細胞，在迷路區與胎兒血管匯合，進行營養物質和代謝產物的轉運。常見的胎盤損傷的類型多表現為交界區海綿絲細胞的凋亡以及迷路區面積減小或血細胞減少，因而以上現象的發生與否也是對胎盤屏障毒性研究的關注重點之一。

1　納米氧化物對胎盤屏障的毒性作用

納米二氧化鈦粒子(nano-TiO 2particles，nTP)因具有良好的紫外線屏蔽功能被廣泛用于防曬霜和汽車涂料，是日常接觸最多的納米材料之一 ［5］;納米二氧化硅粒子(nano-silica particles，nSP)也因優越的穩定性和增稠性成為熱門的無機新材料。常見的納米氧化物還包括納米氧化鋅、納米氧化鋁和納米氧化鐵等。有關納米氧化物的毒理學研究報道較多，其生殖毒性的研究也受到廣泛關注。

Yamashita等 ［6］對妊娠16和17 d的BALB/c小鼠分別尾靜脈注射直徑70，300和1000 nm的nSP(nSP70，nSP300和nSP1000)，羧基和氨基包被的70 nm nSP以及直徑35 nm nTP(nTP35)，并在接受nSP70和nTP35(均為每只0．8 mg)注射的2組小鼠胎盤、胎鼠肝和大腦中發現了相應的納米材料。雖然各組小鼠的胎盤質量幾乎相同，但2組小鼠子宮質量較之其他組分別減少20%和30%，胎鼠體質量減輕10%，胎兒吸收率明顯提高，羊膜囊也較nSP 300，nSP1000及氨基羧基包被nSP處理減小。可溶性血管內皮生長因子受體1作為胎盤細胞表達的重要蛋白之一，在注射nSP70 和nTP35的小鼠血漿中濃度顯著降低，表明小鼠胎盤不僅發生結構改變，正常功能亦受到影響。其中注射nSP70的小鼠發生妊娠合并癥的情況更為明顯，小鼠胎盤經HE染色和病理檢測發現，胎鼠螺旋動脈管未能形成，且胎鼠血竇內血流量減少;而PAS染色則發現，nSP70組小鼠胎盤中海綿絲細胞層占胎盤總面積的比例較對照組減少約50%; TUNEL染色的高陽性率證實注射nSP70的小鼠胎盤海綿絲細胞凋亡明顯，其迷路區絨毛的周長也較對照組顯著下降。然而，用羧基或氨基團對nSP70進行表面修飾可減弱上述不良妊娠合并癥，提示表面電荷可能影響納米材料的毒性作用。

Mohammadipour等 ［7］在Wistar大鼠孕期第2～21天按體質量100 mg·kg －1的劑量連續灌胃粒徑10 nm的nTP(nTP10)，結果發現，子代海馬細胞增殖明顯減緩，學習和記憶能力也明顯下降，提示胎盤屏障未能阻止該納米粒子對胎兒的毒性作用。

Noori等 ［8］對BALB/c孕鼠腹腔注射二巰丁二酸包被的氧化鐵納米粒子后，在胎盤和胎鼠的肝內發現了納米粒子的存在。盡管和胎鼠的數量和體質量相比對照組無明顯下降，但接觸劑量＞50 mg·kg －1的子代小鼠卻發生了明顯的生長遲緩，其中雄鼠的精原細胞、精母細胞、精子細胞和成熟精子的數量也明顯下降。

2　碳納米材料對胎盤屏障的毒性作用

碳納米材料主要包括碳納米球、碳納米纖維和碳納米管 ［9］，其中碳納米管于1991年由日本科學家Lijima ［10］發現，且因其出色的機械強度、良好的電學性能和特殊的毛細管性質等特點而被廣泛用于新材料的研制。Pietroiusti等 ［11］對原始及氧化的單壁碳納米管對CD1小鼠胚胎發育的影響展開了研究。雌性小鼠胚胎植入后(約受精后5．5 d)于球后靜脈注射原始及氧化的單壁碳納米管，劑量為每只10 ng～30 μg。10 d后解剖發現，暴露于氧化單壁碳納米管的雌鼠較原始材料組發生更高比例的早期流產和胎兒畸形，其最低致畸劑量為每只100 ng。其中發育異常的胎盤發生廣泛的血管病變，畸形胎鼠及胎盤氧化應激產物明顯增加;正常發育的胎兒、胎盤及母鼠均無此現象。

然而，使用其他暴露方式的研究卻有不同的實驗結果。Lim等 ［12］每日灌胃給予孕大鼠0，40，200和1000 mg·kg －1，于孕20 d進行剖檢，并未發現各組間胎盤、胎鼠體質量及形態差異。Hougaard等 ［13］對C57BL/6J雌鼠于孕前期單次氣管滴注每只67 μg的多壁碳納米管，與雄鼠同籠妊娠后觀察分娩及子代發育情況。結果發現，多壁碳納米管暴露的孕鼠第1次分娩出現延遲，但母鼠產仔量、雄性子代性成熟后的自主活動、驚嚇反射及每日精子生成量較對照組均無明顯差異。

3　量子點(quantuam dots，QD)對胎盤屏障的毒性作用

QD是一種粒徑在1～100 nm之間的新型半導體納米微晶，作為熒光納米材料，因其具有熒光信號強、熒光壽命長、生物相容性好、激發光譜寬及發射光譜窄等特點，在婦科腫瘤早期診斷、前哨淋巴結成像、體內腫瘤成像和體內腫瘤示蹤等方面都有良好的應用前景 ［14］。algeviˇcien．e等 ［15］在Wistar大鼠胚胎發育的第6，13和18天腹腔注射CdSe/ZnS QD(0．8 μmol·L －1，每只500 μL)和CdTe QD(5 mg·kg －1)，第21天與陽性對照組(環磷酰胺15 mg·kg －1)和生理鹽水對照組比較胎鼠吸收率、體質量、體長及胚胎外部畸形情況。相對于環磷酰胺的致畸性，CdSe/ZnS QD及CdTe QD在以上胚胎發育階段均未發現任何胚胎致畸作用。熒光光譜和熒光顯微鏡的結果發現，QD熒光反應主要聚集在胎盤的迷路區，而胚胎組織內并未觀察到明顯的存在跡象，提示胎盤屏障可能減弱了該納米材料的毒性作用。

Chu等 ［16］對QD通過胎盤屏障及在昆明小鼠胚胎的聚集情況進行了研究。母鼠分娩前1～5 d，完整的胎盤屏障已經形成，研究人員在該階段對母鼠尾靜脈注射350 μL分別含有20，50，86和125 μg Cd的5種CdTe/CdS QD〔文中依QD最大發射波長命名為QD(532)、QD(599)、QD(656)以及包被二氧化硅和高分子聚乙二醇的QD(656)〕，并于分娩后檢測仔鼠體內鎘離子含量。實驗發現，QD對胎盤屏障的滲透能力與其粒徑呈負相關，即粒徑越小，仔鼠內可檢測的鎘離子濃度越高。而當QD包裹了二氧化硅或高分子聚乙二醇后，通過胎盤屏障的能力則會減弱。

Hsieh等 ［17］在ICR小鼠的卵母細胞發育的早期加入CdSe QD 0～500 nmol·L －1和CdSe/ZnS QD 500 nmol·L －1，共孵育24 h后移除，并將受精后的胚囊植入母鼠體內繼續發育，觀察其對卵母細胞成熟、受精、著床前后及胚胎植入后發育情況的影響。實驗發現，CdSe QD 250和500 nmol·L －1顯著減少了卵母細胞成熟，受精和體外胚胎發育的比例，但ZnS包覆的CdSe QD影響明顯減弱。其中在體外成熟階段，卵母細胞經CdSe QD 500 nmol·L －1干預后發育的胚胎，出現了著床后吸收胎率增加、胎盤胎兒體質量明顯減輕的情況，提示CdSe QD對胚胎植入后的發育潛力有較為明顯的毒性效應。

4　金屬納米材料對胎盤屏障的毒性作用

常見金屬的納米粒子主要有納米金(AuNP)、納米銀(AgNP)和納米銅等。自16世紀Paracelsus制備出“飲用金”用來治療精神類疾病以來，AuNP就開始受到關注并被逐漸應用到多個行業。AuNP在水中形成的分散系　膠體金，因能在迅速吸附大分子蛋白的同時不改變其生物活性等優點被廣泛用于免疫標記領域，而AuNP標記技術也逐漸發展成現代四大免疫標記技術之一 ［18］。Semmler-Behnke等 ［19］通過氣管內染毒及靜脈注射的方法將健康成年Wistar大鼠暴露于1．4及18 nm經 198Au標記的金納米粒子( 198AuNP)，24 h后用單光子發射計算機斷層掃描儀(SPECT)檢測 198AuNP的生物分布情況。結果發現，經靜脈注射染毒的大鼠， 198AuNP在胎盤和胎鼠內的分布與粒徑呈反比，其中1．4 nm 198AuNP注射組胎盤內Au含量為注射劑量的3%胎鼠內為0．06%，18 nm 198AuNP注射組胎盤內Au含量為注射劑量的0．02%，胎鼠內為0．005%。

Tian等 ［20］通過對患有子宮內膜炎的C57BL/6孕小鼠注射不同粒徑的AuNP(0．9 μg Au·g －1)發現，3及13 nm的AuNP在宮內炎癥情況下到達胎鼠的量較健康孕鼠明顯增多，而32 nm AuNP在兩者胎鼠中均未檢測到。該結果提示，在宮內炎癥情況下可能導致胎盤結構功能異常，進而增加納米材料危害胎兒的風險，同時也驗證了納米材料通過胎盤屏障的程度與材料粒徑大小密切相關。

Yang等 ［21］給胎齡5．5～15．5 d的CD-1孕小鼠尾靜脈注射鐵蛋白、高分子聚乙二醇和檸檬酸修飾的13 nm AuNP(0．9 mg Au·g －1)。結果發現，雖然孕鼠并無任何中毒癥狀，胎鼠中仍能檢測到較高濃度的AuNP，而胚外組織如胎盤、羊膜、子宮壁和臍帶中AuNP的濃度為胎鼠的6～15倍。但若在胎齡11．5 d之后接受注射，則胎鼠AuNP的含量卻急劇下降。與之吻合的是，小鼠的胎盤血液供應和屏障形成在胎齡10 d左右，提示胎盤屏障的形成是影響胎鼠接觸納米材料的關鍵因素。此外，鐵蛋白和高分子聚乙二醇修飾的AuNP在胎兒和胚外組織內的含量較檸檬酸修飾的AuNP明顯增多，再次驗證表面修飾對納米材料通過胎盤屏障程度有重要影響。

AgNP因其有效光譜的抗菌作用受到廣泛關注，并已逐漸應用于各類抑菌藥物的研制開發中，然而其生殖毒性作用仍未被完全闡明。Melnik等 ［22］對懷孕20 d及哺乳期的雌性Wistar大鼠灌胃注射 110 mAg標記的粒徑為(34．9±14．8)nm的AgNP，24 及48 h后用低背景半導體γ射線譜儀分別檢測胎鼠和分娩后子鼠體內 110 mAgNP的累積情況。結果發現，染毒劑量為1．69和2．21 mg·kg －1組的胎鼠體內 110 mAgNP的含量分別達到了給藥劑量的0．147% 和0．085%，與母大鼠肝、血液和肌內的含量相當。而染毒劑量為2．11 mg·kg －1的母大鼠經48 h哺乳后，子鼠體內 110 mAgNP的含量達到了給藥劑量的(1．94±0．29)%，其中約25%吸收至仔鼠的胃腸道，提示AgNP能通過大鼠胎盤，并能通過哺乳傳遞至子代。

5　展望

納米材料因其粒徑小和獨特的理化性質，可通過胎盤屏障并影響胎兒生長發育，其通過率隨著納米材料的粒徑減小而增大，也隨表面修飾材料或其他理化性質的改變而變化。納米材料在胎盤屏障的通過率與粒徑呈負相關的現象與胎盤屏障的孔徑大小有密切聯系，而表面修飾材料對納米材料的影響則可能與以下2個方面有關:①表面材料改變了納米材料的粒徑大小，導致超過胎盤孔徑的大尺寸材料較難通過;②表面材料可能改變了納米粒子的屬性，例如將原本較易通過的脂溶性粒子包裹上親水包被，而使其較難被胎盤組織間的細胞攝取 ［23］。

胎盤在妊娠過程中承擔著物質轉運、激素分泌和維持正常免疫功能的作用，是妊娠過程穩定和胎兒正常發育的重要保障。隨著納米材料的迅速發展和廣泛應用，孕期接觸納米材料的概率也大大提高。通過對納米材料孕期暴露的研究發現，對納米材料胎盤屏障毒性的機制可能包括如下內容:①納米粒子的磁性吸附作用或其他特性導致其在胎盤血管沉積，阻礙母-胎間的物質轉運，導致胎兒生長受限等不良結局;②納米粒子本身，例如含鎘QD等，誘導胎盤海綿絲細胞凋亡，導致胎盤正常結構的改變，使原本“緊密”的屏障變得“疏松”，使得納米材料更易通過;③納米材料對胎盤細胞的損傷破壞其正常的激素分泌功能，使得妊娠無法繼續維持而誘發流產;④某些納米材料對母體及胎盤的刺激誘導免疫因子的不正常分泌，破壞妊娠同種異體移植的免疫平衡，導致各種免疫并發癥的產生。

隨著納米材料的廣泛應用，關于其生殖毒性的研究越來越多，但由于實驗動物器官結構和人類不可避免的差距，且目前的毒理學實驗也缺乏統一執行標準，難以對諸多種類的納米材料進行科學完善的評價。因此，在針對不同納米材料進行研究的同時，對毒理學實驗方法的統一和評價系統標準的探索，也是納米材料發展的重要環節。