阿爾茨海默病患者血漿microRNA-101a-3p的表達(dá)

段冉冉　彭　濤　李燕飛　高慧麗　王笑寒　王景濤　滕軍放　賈延劼(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室，河南　鄭州　450000)

阿爾茨海默病患者血漿microRNA-101a-3p的表達(dá)

段冉冉彭濤李燕飛高慧麗王笑寒王景濤滕軍放賈延劼
(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室，河南鄭州450000)

〔摘要〕目的探討microRNA在阿爾茨海默病(AD)患者血漿中的差異變化，以尋求一個可能作為輔助診斷AD的早期生物標(biāo)志物。方法實驗分為患者組和健康對照組，分別取其血漿并提取microRNA，利用microRNA基因芯片和熒光定量PCR的方法尋找有表達(dá)差異的microRNA。結(jié)果基因芯片篩選出68個AD相關(guān)的差異表達(dá)microRNAs基因(P＜0．05)，其中miR-101a的表達(dá)水平在AD患者中顯著低于對照組(log=－5．53，P =1．19×10－5)，選定為感興趣miRNA;熒光定量PCR示:患者組中miR-101a的相對表達(dá)量為8.834×10－4±2.842×10－4，對照組為6.305×10－3±1.161 ×10－3。患者組表達(dá)量僅為對照組14％，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 21．76，P＜0．001)，結(jié)果與miRNA芯片檢測結(jié)果一致。ROC示:如果以0．002 163為診斷臨界值，即miR-101a相對表達(dá)量低于0．002 163提示診斷AD。結(jié)論miR-101a可能通過多種途徑影響AD的發(fā)生發(fā)展，可能作為一種輔助診斷AD的早期生物標(biāo)志物。

〔關(guān)鍵詞〕阿爾茨海默病; microRNA

第一作者:段冉冉(1989-)，女，碩士，主要從事阿爾茨海默病研究。

The expression of plasma microRNA-101a-3p in Alzheimer disease patients

DUAN Ran-Ran，PENG Tao，LI Yan-Fei，et al.
Department of Neurology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，Henan，China

【Abstract】Objective To investigate the expression of plasma microRNA(miR) -101a-3p in Alzheimer disease(AD) patients．Methods The subjects were divided into patient and healthy controls groups．MicroRNAs were extracted from plasma of cases and measured by gene microarray and real-time PCR．Results Gene microarray and real-time PCR showed that the expression level of miR-101a-3p in AD patients was significantly reduced compared to that of healthy people．Conclusions MiR-101a might be used as a diagnostic biomarkers in the early AD patients．

【Key words】Alzheimer disease; microRNA

阿爾茨海默病(AD)是一類病因未明的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，目前臨床上缺乏早期診斷的標(biāo)準(zhǔn)和有效的治療措施。循環(huán)微小RNA(microRNA)是一種穩(wěn)定存在于血漿、血清中的microRNA，其表達(dá)水平在腫瘤、糖尿病以及多種神經(jīng)退行性疾病中存在特異變化〔1～3〕。同時，循環(huán)microRNA還具有不易降解、檢測方法敏感、準(zhǔn)確等特點〔4〕。這些都提示循環(huán)microRNA可以作為潛在生物標(biāo)志物輔助相關(guān)疾病的診斷。本文通過檢測AD患者與健康人血漿microRNA差異表達(dá)情況，試圖尋找一種可能作為輔助診斷AD的早期生物標(biāo)志物。

1　資料和方法

1.1研究對象選取2012年4月至2013年4月就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及病房的AD患者28例及同期住院的非AD健康老年人和部分體檢中心的健康體檢者共35例為研究對象。進(jìn)行基因芯片檢測的AD患者和對照組患者各5例，均為男2例，女3例，AD組患者年齡(64±2.3)歲，對照組為(64.4±2.81)歲。進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測的AD患者23例，男12例，女11例，年齡(63.57±0.9)歲;對照組30例，男女各15例，年齡(65±0.98)歲。兩組間人員的年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

1.1.1病例組入選標(biāo)準(zhǔn)所有患者均進(jìn)行臨床檢查、簡易精神狀態(tài)量表篩查(MMSE)，得分低于臨界值(文盲≤17分、小學(xué)≤20分、初中及以上≤24分) ; Hachinski缺血指數(shù)量表≤4 分;患者無抑郁，漢米爾頓抑郁量表(17項版本)＜7分;并經(jīng)過至少1名神經(jīng)科醫(yī)生診斷，符合美國國立神經(jīng)病學(xué)、語言障礙和卒中-老年癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會工作組(NINCDS-ADRAD)的“很可能是AD”的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者無陽性家族史。

排除標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)臨床癥狀，病情進(jìn)展特點和影像學(xué)檢查，排除其他疾病引起的老年癡呆，如血管性癡呆、腦炎、腦外傷后遺癥以及其他精神疾病。

1.1.2對照組入選標(biāo)準(zhǔn)與病例組年齡、性別、生活環(huán)境相似的非癡呆老年人，并對患者病史的詳情及身體狀況進(jìn)行了解，排除了對照組患者抑郁、腦血管疾病及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可能性;對照組患者無血液病、惡性腫瘤、嚴(yán)重的肝腎功能不全、感染疾病等其他疾病。

本實驗得到鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的承認(rèn)與允許，所有標(biāo)本的采集均獲得入組人員的知情同意。

1.2方法

1.2.1血漿樣本的收集及處理抽取每例受試者外周血于氟化鈉/草酸鉀管內(nèi)，并在2 h內(nèi)，于4℃、3 000 r/min離心10 min，留取上層血漿置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血漿microRNA的提取按照miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根公司DP501)說明書，采用吸附柱法提取血漿microRNA。

1.2.3microRNA芯片檢測血漿miRNA表達(dá)水平將者血漿microRNA樣本分別通過加poly(A)尾與一個寡聚核苷酸標(biāo)記用于后續(xù)的熒光標(biāo)記，然后在LC Sciences-μParafloTM微流體芯片上雜交過夜。在微流體芯片上，每條檢測探針都是由一個化學(xué)修飾核苷酸編碼段(與目標(biāo)miRNA互補(bǔ))和一個由聚乙二醇組成的間隔段組成。microRNA與探針雜交后，與標(biāo)記特異結(jié)合的Cy3染料在微流體芯片上循環(huán)流動進(jìn)行染色。最后利用激光掃描儀采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。探針序列均來源于miRBase (http: / / www.mirbase.org/)，每張芯片可檢測，共可檢測2 042條人類microRNA(Sanger R19.0)。microRNA芯片檢測試驗由杭州聯(lián)川公司完成。

1.2.4實時定量PCR驗證芯片檢測結(jié)果按照Reverse Transcription System (美國Promega公司A 3500)說明書，將microRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照GoTaq?qPCR Master Mix(美國Promega公司A6001)說明書進(jìn)行熒光定量PCR，以5 s為內(nèi)參。5 s、miR-101a-3p引物由武漢銳博公司提供。實時定量PCR檢測在LightCycler 1.5儀器(瑞士Roche公司)進(jìn)行。以2-ΔΔCt表示每個microRNA的相對表達(dá)量，每例樣本重復(fù)檢測3次，實驗過程中采用盲法研究。

2　結(jié)果

2.1microRNA芯片檢測結(jié)果通過芯片對5例AD患者和5例對照組血漿microRNA進(jìn)行定量檢測，結(jié)果提示，可篩選出68 個AD相關(guān)的差異表達(dá)microRNAs基因(P＜0.05) ; 27個AD患者血漿表達(dá)下調(diào)，41個表達(dá)上調(diào)。其中表達(dá)下調(diào)5倍以上基因的是miR-107、miR-29a、miR-29b、miR-15a、miR-19b、let-7i、miR-101a-3p、miR-106b、miR-22、miR-98、miR-30c;表達(dá)上調(diào)3倍以上的是miR-128、miR-146a、miR-26a、let-7b、miR-30e等。

以兩組間microRNA表達(dá)量的差異倍數(shù)，即相對表達(dá)量(log2)的絕對值＞2.0且t檢驗P＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)miR-101a-3p的表達(dá)水平在AD患者中顯著低于對照組(log2= －5.53，P=1.19×10－5)。

2.2實時熒光定量PCR驗證芯片檢測結(jié)果通過實時熒光定量PCR方法對23例患者、30名健康對照的芯片檢測結(jié)果進(jìn)行驗證，患者組中miR-101a-3p的相對表達(dá)量為8.834×10－4± 2.842×10－4，對照組為6.305×10－3±1.161×10－3?；颊呓M表達(dá)量僅為對照組的14％，兩組間差異顯著(F= 21.76，P＜0.001)，結(jié)果與miRNA芯片檢測結(jié)果一致。

2.3miR-101a-3p對AD的診斷效能ROC分析結(jié)果顯示，通過miR-101a-3p的相對表達(dá)量對AD進(jìn)行診斷時，曲線下面積(AUC)為0.872 5;如果以0.002 163為診斷臨界值，即miR-101a-3p相對表達(dá)量低于0.002 163提示診斷AD，約登指數(shù)最大，為0.646 3;靈敏度和特異度均較高，分別為0.913和0.733。

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)miR-101a-3p在AD患者血漿中表達(dá)水平顯著低于健康人水平，并初步確定了通過miR-101a-3p輔助診斷AD的臨界值。若以0.002 163為臨界值，靈敏度和特異度均較高，但是考慮到本研究的樣本量較小，該臨界值的可行性及可重復(fù)性仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證。

有研究表明miR-101能靶向作用于EZH2基因的3’端非翻譯區(qū)參與基因沉默，又可以通過調(diào)控Mcl-1、Cox-2和Fos等癌基因或類癌基因影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展〔5，6〕。在AD方面的研究較少，尤其在循環(huán)血中miR-101的表達(dá)變化，而本實驗利用microRNA芯片及實時熒光定量PCR技術(shù)彌補(bǔ)了這方面的空白。早期的研究表明〔7〕，在AD患者的腦組織內(nèi)miR-101的表達(dá)是下調(diào)的。miR-101可能通過AD的三個發(fā)病機(jī)制影響AD病程的進(jìn)展:①miR-101通過miRNA/RISC(RNA-induced silencing complex，RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)途徑降低淀粉樣前體蛋白(APP)的表達(dá)水平，從而降低β淀粉樣蛋白(Aβ)的水平〔8〕。②下調(diào)的miR-101導(dǎo)致環(huán)氧合酶-2(COX-2)的上調(diào)，從而促進(jìn)炎癥〔7〕。③miR-101的失調(diào)間接地有助于異常的tau蛋白磷酸化，從而促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTF)的增加〔9〕。有研究提示，循環(huán)microRNA是多種細(xì)胞通過出芽、胞吐等方式主動分泌并以外切體或者結(jié)合高密度脂蛋白形式穩(wěn)定存在于血漿中的〔4〕。同時，還有研究顯示血漿中的microRNA可以通過結(jié)合特異受體并以胞吞作用的方式再次進(jìn)入細(xì)胞中，因此有學(xué)者認(rèn)為循環(huán)microRNA可能像激素或細(xì)胞因子一樣作為不同細(xì)胞間互相影響的中介物質(zhì)〔10，11〕。結(jié)合本研究結(jié)果，在血液系統(tǒng)中循環(huán)miR-101a-3p可能間接反映腦組織內(nèi)miR-101a-3p的表達(dá)變化，但AD患者血漿中miR-101a-3p表達(dá)水平下降的原因和機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示miR-101a-3p在AD患者中的表達(dá)量顯著降低，可能作為AD的一種潛在的生物標(biāo)志物，但miR-101a-3p表達(dá)水平與AD的診斷是否具有特異性，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證，以明確不同程度認(rèn)知功能障礙患者間的miR-101a-3p的表達(dá)量是否存在差異。

4　參考文獻(xiàn)

1 Hebert LE，Weuve J，Scherr PA，et al.Alzheimer disease in the United States (2010-2050) estimated using the 2010 census〔J〕．Neurology，2013; 80(19) : 1778-83.

2 Junn E，Mouradian MM.MicroRNAs in neurodegenerative diseases and their therapeutic potential〔J〕．Pharmacol Ther，2012; 133(2) : 142.

3 Karolina DS，Tavintharan S，Armugam A，et al.Circulating miRNA profiles in patients with metabolic syndrome〔J〕．J Clin Endocrinol Metab，2012; 97(12) : E2271-6.

4 Mo MH，Chen L，F(xiàn)u Y，et al.Cell-free Circulating miRNA biomarkers in cancer〔J〕．J Cancer，2012; 3(4) : 432-4.

5 Varambally S，Dhanasekaran S，Zhou M，et al.The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer〔J〕．Nature，2002; 419(6907) : 624-9.

6Wang H，Ruan H，He X，et al.MicroRNA-101 is down-regulated in gastric cancer and involved in cell migration and invasion〔J〕．Eur J Cancer，2010; 46(12) : 2295-303.

7 Long JM，Lahiri DK.MicroRNA-101 downregulates Alzheimer＇s amyloidbeta precursor protein levels in human cell cultures and is differentially expressed〔J〕．Biochem Biophys Res Commun，2011; 404(4) : 889-95.

8 Vilardo E，Barbato C，Ciotti M，et al.MicroRNA-101 regulates amyloid precursor protein expression in hippocampal neurons〔J〕．J Biol Chem，2010; 285 (24) : 18344-51.

9 Sachdeva M，Wu H，Ru P，et al.MicroRNA-101-mediated Akt activation and estrogen-independent growth〔J〕．Oncogene，2011; 30 (7) : 822-31.

10 Vickers K，Remaley A.Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication〔J〕．Curr Opin Lipidol，2012; 23 (2) : 91-71.

11 Duttagupta R，Jiang R，Gollub J，et al.Impact of cellular miRNAs on circulating miRNA biomarker signatures〔J〕．PLoS ONE，2011; 6(6) : e20769.

〔2014-08-16修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者:賈延劼(1971-)，男，主任醫(yī)師，博士后，博士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病及癡呆的研究。

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(30770758，81071114)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4421-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.002