熒光原位雜交技術在上尿路上皮細胞癌診斷中的應用

易文發 曹會彥 劉智明 乜國雁 章曉東 王國錄 于 湧

(青海省人民醫院泌尿外科，青海 西寧 810007)

上尿路上皮細胞癌(腎盂、輸尿管癌)是一種較為罕見的腫瘤，年發病率(0.7～1.1)/10萬，在過去的30年略有增加。2009年我們應用熒光原位雜交技術(FISH)初步探討了其在中國人群中診斷膀胱癌的作用〔1〕。分子遺傳學研究表明，上尿路尿路上皮和膀胱上皮組織來源、遺傳學改變相同，應用FISH檢測上尿路尿路上皮細胞癌在理論上是可行的〔2〕。本文探討FISH在早期診斷上尿路尿路上皮細胞癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 50例無肉眼血尿及其他泌尿系統疾病的正常對照組，年齡46～82(平均62.6)歲。56例疑似尿路移行上皮腫瘤的肉眼血尿患者組，男44例，年齡47～83(平均60.4)歲，女12例，年齡50～84(平均64.2)歲。所有入選病例均簽署知情同意書。

1.2 尿液留取及檢測 106例入選病例連續3 d留取晨尿200 ml，1 h內送檢，一部分進行FISH檢測，另一部分經離心后制備脫落細胞玻片，由指定的經驗豐富的病理科醫師進行細胞形態學檢查。

1.3 FISH檢測方法 采用金菩嘉醫療科技有限公司提供的DNA探針。其中包括CSP3/CSP7和GLP P16/GLP P17探針，采用熒光顯微鏡檢查，均可見紅色與綠色兩種信號。GLP P16/GLP P17DNA探針常見異常類型主要為P16缺失;17號染色體呈非整倍性，正常細胞檢測結果應為2紅2綠，異常信號主要包括:0紅 2綠、1紅 2綠、1紅 3綠及 2紅 3綠。CSP3/CSP7DNA探針常見異常表現為3號及7號染色體呈非整倍性，正常細胞檢測結果應為2紅2綠，異常信號主要包括:2紅3綠、3紅2綠及3紅3綠等。

1.3.1 準備探針混合物和變性 室溫下將7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和2 μl DNA探針加入微量離心管中，將其離心1～3 s。將裝有10 μl以上DNA探針混合物的試管置于(73±1)℃水浴箱變性5 min，之后，將該試管放置于45℃ ～50℃水浴箱中，在雜交前將混合物試管取出。在探針準備好的同時應將載玻片置于45℃ ～50℃烤片機上預熱。

1.3.2 探針與樣本雜交 將10 μl變性后的探針混合物滴于載玻片雜交區域后立即加蓋蓋玻片，用橡皮膠將邊緣密封，隨后，將載玻片放置于提前預熱的濕盒中，在42℃保溫箱中進行過夜雜交。

1.3.3 玻片洗滌 在室溫下將配置好的50%甲酰胺/2×(SSC)溶液(A 液)倒入三個分別標記為“a”、“b”、“c”的考普林瓶中。注意在使用前應將盛有溶液的考普林瓶放置于(46±1)℃水浴箱中預熱至少30 min，以使溶液達到實驗所需要的溫度。然后，分別將50 ml 2×SSC溶液(B液)和2×SSC/0.1%NP洗液(C液)倒入考普林瓶中，同上，在使用前應將盛有溶液的考普林瓶預熱至少30 min，使溶液達到所需溫度。下一步，移去蓋玻片，立即將載玻片置于“a”中，晃動玻片1～3 s。按此步驟重復另外幾張載玻片，5～10 min后取出。然后，將載玻片置于“b”中，晃動1～3 s，5～10 min后取出。同樣，將載玻片置于“c”中，晃動玻片1～3 s，5～10 min后取出玻片。后將載玻片置于盛有B液中，晃動玻片1～3 s，10 min后取出玻片。重復上述步驟，將載玻片置于盛有C液中，晃動1～3 s，5 min后取出，最后，室溫浸泡在70%乙醇中，3 min后取出。

1.3.4 觀察方法 暗室內使載玻片自然干燥，然后將5 μl DAPI復染劑滴加在雜交區域，立即蓋上蓋玻片。在暗處放置10～20 min后，熒光顯微鏡下選用合適的濾波片組進行觀察。

1.4 FISH檢測結果判定 熒光顯微鏡下觀察不典型細胞以便對玻片進行評估，同時對上述細胞中信號的數目計數。對每個樣本每種探針各分析100個細胞，如果檢測值大于閾值，則判定為陽性結果;如果檢測值小于閾值，則判定為陰性結果。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0軟件行χ2檢驗。

2 結果

2.1 診斷閾值 50例正常人尿液閾值分析為:CSP3、CSP7、GLP、P16、GLP P17有1個信號點的細胞比例分別為:9.22%、6.76%、5.95%及6.78%;有3個及以上信號點的細胞比例分別為11.92%、12.64%、5.18%及7.66%。

2.2 FISH檢測的結果 以輸尿管鏡檢查和術后病理檢查為診斷標準，56例行FISH檢測的患者，通過輸尿管鏡活檢或手術后病理檢查明確診斷為上尿路上皮細胞癌患者51例，泌尿系良性病變為5例，包括輸尿管炎性病變、輸尿管結核等。

2.3 FISH在上尿路上皮細胞癌診斷中的敏感性和特異性對106例行FISH檢測的病例對于腫瘤的敏感性為91.1%，特異性為92.0%。尿脫落細胞學的敏感性為33.9%，特異性為94.0%。FISH與尿脫落細胞學在診斷上尿路上皮細胞癌中敏感性有統計學意義(P＜0.01)，特異性無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

上尿路上皮細胞癌較罕見，其占尿路上皮細胞癌的5%〔3〕，目前，上尿路上皮細胞癌的早期診斷相對比較困難，其診斷方法主要依靠尿脫落細胞學、輸尿管鏡及影像學檢查。尿脫落細胞學檢查雖然特異性較高，但由于靈敏度低，僅為21% ～60%〔4〕，在上尿路尿路上皮細胞癌的早期診斷中的作用極為有限，此點在本次研究中亦有所體現，另外，尿脫落細胞學陽性判斷與檢驗者的經驗、水平有很大的關系〔5〕，不能提供一個較為客觀的結果。輸尿管鏡為我們提供了一種靈敏度較高的方法，但缺點在于其為有創檢查，患者痛苦，難以接受，且有可能發生輸尿管穿孔等嚴重并發癥，限制了它的廣泛應用，另外，輸尿管鏡檢查對原位癌的檢查陽性率極低，很難明確診斷〔6〕。影像學檢查包括泌尿系超聲、CT、MRI等檢查，雖說有一定的診斷價值，但對早期的上尿路尿路上皮細胞癌的診斷較為困難〔7〕，往往有特征性表現時已經發展為中晚期，預后不佳。

FISH是比較新興的分子遺傳學技術，目前它已廣泛應用于動植物基因結構、人類產前診斷、腫瘤遺傳學病毒感染分析、染色體精細結構變異分析以及基因進化研究等各領域。FISH檢測的主要方法是采用熒光標記的DNA探針，依據DNA探針與被檢測樣本中DNA序列的互補性，將兩者雜交后在熒光顯微鏡下檢測DNA序列進行定位、定性以及相對定量分析。此項技術本身操作相對簡單，重復性好、穩定，并具有極高的敏感性和特異性。正由于FISH有上述技術特點及優越性，作為一門新技術其被越來越多地應用于臨床醫學檢測。

本研究結果說明應用FISH技術進行遺傳學改變的檢測對上尿路上皮癌的早期診斷具有良好效果，表明其靈敏度明顯高于細胞形態學檢測，而特異性則與細胞形態學相當。FISH相比輸尿管鏡及尿脫落細胞學檢查具有無創、敏感性及特異性高等優點，對經過輸尿管鏡和尿脫落細胞學檢查結果陰性而又高度懷疑上尿路上皮癌的患者來說又多了一種無創、簡便、高效的檢測方法。

本研究中，FISH組出現5例假陰性，可能與腫瘤小、級別低、僅限于黏膜層致尿脫落細胞少或細胞尚未發生遺傳學改變有關〔8〕。出現4例假陽性，也許并不能完全排除尿路上皮癌的可能，有報道指出在11例檢查陰性而FISH檢測陽性的患者在3～12個月的隨訪中發現7例罹患尿路上皮癌〔9〕。說明雖然經輸尿管鏡等檢查結果陰性而FISH陽性的患者，日后其患尿路上皮癌的風險仍很高，需密切隨診。本研究將對4例假陽性病例長期隨訪，進一步證實其是否為尿路上皮癌高風險病例。

綜上，FISH作為一種新興技術在上尿路上皮細胞癌的早期診斷和預后評估中相比尿脫落細胞學顯示出其高敏感性、高特異性及無創性的優點。但因其探針相對價格較高，目前廣泛應用于臨床尚有一定的難度。隨著此項技術的成熟及試劑成本的降低，相信FISH技術在上尿路尿路上皮細胞癌的早期診斷中將有著廣泛的臨床應用前景。

1 曹會彥，劉智明，乜國雁，等.熒光原位雜交技術在膀胱癌診斷中的臨床應用〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(15):2809-11.

2 Fadl-Elmula I，Gorunova L，Mandahl N，et al.Cytogenetic analysis of upper urinary tract transitional cell carcinomas〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，1999;115:123-7.

3 Oosterlinck W，Solsona E，Van der Meijden AP，et al.EAU guidelines on diagnosis and treatment of upper urinary tract transitional cell carcinoma〔J〕.Eur Urol，2004;46:147-54.

4 Mian C，Mazzoleni G，Vikoler S，et al.Fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of upper urinary tract tumours〔J〕.Eur Urol，2010;58:288-92.

5 Lotan Y，Roehrborn CG.Sensitivity and specificity of commonly available bladder tumor markers vs cytology:results of a comprehensive literature review and meta-analyses〔J〕.Urology，2003;61:109-18.

6 Siemens DR，Morales A，Johnston B，et al.A comparative analysis of rapid urine tests for the diagnosis of upper urinary tract malignancy〔J〕.Can J Urol，2003;10:1754-8.

7 Mills IW，Laniado ME，Patel A.The role of endoscopy in the management of patients with upper urinary tract transitional cell carcinoma〔J〕.BJU Int，2001;87:150-62.

8 Jose P，Blanca E，Marta S，et al.Clinical utility of a multiprobe FISH assay in voided urine specimens for the detection of bladder cancer and its recurrences，compared with urinary cytology〔J〕.Eur Urol，2002;42:547-52.

9 Halling KC，King W，Sokolova IA，et al.A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma〔J〕.J Urol，2000;164(5):1768-75.