單核苷酸多態性檢測方法研究進展

常培葉　趙　平(內蒙古醫科大學附屬醫院核醫學科，內蒙古　呼和浩特　00050)

單核苷酸多態性檢測方法研究進展

常培葉趙平1
(內蒙古醫科大學附屬醫院核醫學科，內蒙古呼和浩特010050)

〔關鍵詞〕單核苷酸多態性;基因

1內蒙古自治區人民醫院心內科

第一作者:常培葉(1975-)，女，博士，副教授，主要從事內蒙古地區少數民族生活習慣和易感基因的研究。

單核苷酸多態性(SNP)占所有已知多態性的90％以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1 000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。SNP分析技術按其研究對象主要分為兩大類，①對未知SNP進行分析，即找尋未知的SNP或確定某一未知SNP與某遺傳病的關系。檢測未知SNP有許多種方法可以使用，如溫度梯度凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳、單鏈構象多態性、變性的高效液相色譜檢測等，但這些方法只能發現含有SNP的DNA鏈，不能確知突變的位置和堿基類別，要想做到這一點，必須對那些含有SNP的DNA鏈進行測序。②對已知SNP進行分析，即對不同群體SNP遺傳多樣性檢測或在臨床上對已知致病基因的遺傳病進行基因診斷。篩查已知SNP的方法有等位基因特異寡核苷酸片段分析、突變錯配擴增檢驗、基因芯片技術等。本文對SNP檢測方法的研究現狀予以綜述。

1　基因芯片法

基因芯片是在固相支持介質上進行分子雜交并原位熒光檢測的一種高通量SNP分析方法。根據核苷酸的堿基配對原理，設計兩種或多種探針，在優化操作后，探針只與其完全互補的序列雜交，不與含有單個錯配堿基的序列雜交。待測基因經提取擴增、熒光化學標記后，與固定的探針進行雜交。然后洗去沒有發生雜交的樣品，即可檢測雜交樣品。由于目標基因和探針雜交的程度與熒光強度及種類相關，因此通過激光掃描，可根據熒光強弱或熒光的種類檢測出被檢序列的堿基類別。其優點是高通量，一次實驗可對多個進行大規模篩選，需要少量的被檢起始材料，操作步驟簡便，但其缺點是芯片設計制造昂貴，約有20％的不能證實。

2　分子內標法

分子內標探針能準確可靠地探測特異等位基因序列，可用于已知SNP的檢測和新SNP的發現。它用熒光染料內標寡核苷酸制成探針，探針與互補的DNA序列雜交時，發出的熒光強度比未雜交的單鏈高許多。作為雜交結果，熒光強度的變化可以用來監測實時聚合酶鏈式反應(PCR)反應進程和鏈熔解曲線，從而識別SNP的變化。由于探針在反應中不依賴于其二級結構，因此，對探針的限制條件較少，設計簡單，合成費用低，并且有強大可靠的多通路探測能力。分子內標法已開發形成Hy-Beacon探針〔1〕，對NAT2和細胞色素2D6酶(CYP2D6)的9個SNP檢測初步表明，準確度可達100％，但該方法的特異性、敏感性仍然在評價之中〔2〕

3　雙向等位特異法(Bi-PASA)

Bi-PASA〔3〕是在等位特異PCR法〔4〕的基礎上發展而來。PASA其原理是在PCR反應體系中，所設計的引物3'端與一條待測等位基因的序列互補，而與另一條等位基因的序列不互補。該方法雖然可檢測出SNP，但實驗步驟繁瑣，對引物設計要求較高。其優點為操作簡單易行，經濟，缺點是該方法在液相中進行，因此多重平行反應數量有限，難以實現SNP的高通量檢測。

4　以熒光共振能量傳遞(FRET)為基礎的檢測方法

4.1熒光定量PCR技術(TaqMan技術) TaqMan探針基于雜交原理，是按常規方式進行體外基因擴增，在反應體系中加入針對位點及側翼序列設計的探針，該探針只有一個堿基的差異，分別對應于不同的等位基因，并用熒光標記探針。該方法優點在于反應在過程中進行，無需分離或洗脫過程，從而減少了污染的可能性;擴增產物分析簡便、快捷、準確、無需電泳，提高了實驗速度〔5〕，缺點是所設計的探針僅有一個堿基的差異，檢測結果存在假陽性。

4.2能量轉移標記的等位特異PCR據報道可以將能量轉移標記引物法與等位特異PCR法相結合，應用于SNP的檢測〔6，7〕。該方法的優點是靈敏度高、準確、經濟、省時。

5　變性高效液相色譜(DHPLC)

DHPLC分離DNA分子的原理:純合雙鏈DNA分子的分離類似于陰離子交換層析，離子對反相高效液相色譜法借助吸附在固定相表面的三乙氨基乙酸離子的正電荷與DNA分子的磷酸二酯基團的負電荷間的相互作用，對雙鏈DNA分子按長度進行分離。DHPLC檢測〔8〕一個樣品僅需幾分鐘，為全自動化操作，篩檢SNP的效率優于各種電泳法，因此可以先通過DHPLC對PCR產物進行粗篩，再對其中峰型特異者測序確認，這樣可以降低成本，提高檢測SNP的效率。

6　基質輔助激光解吸附/電離飛行時間質譜

其原理是將變性的單鏈產物通過與硅芯片上的化合物共價結合后，在硅芯片上進行引物的退火、延伸反應、突變部位配對的堿基與正常配對的堿基不相同。根據引物在延伸反應中所結合的不同堿基的不同質量在質譜儀上顯示不同峰。將堿基進行一定的修飾，可進一步提高敏感性〔9～11〕。該方法優點在于無需對靶序列進行PCR擴增。結合了侵染檢測高效，單堿基擴增和基質輔助激光解吸附/電離飛行時間質譜實驗快速，準確及等溫和固相樣本準備，從而使得該方法適用于高通量SNP的檢測。

7　多元焦磷酸測序

在焦磷酸測序的基礎上發展起來的一種檢測SNP的方法。焦磷酸測序的原理: PCR擴增DNA，擴增產物變性成單鏈后與一小段測序引物結合;測序時順序加入脫氧核糖核苷三磷(dNTP)，DNA鏈合成過程中，如果三磷酸脫氧核苷酸結合到DNA鏈上，則釋放焦磷酸，反應系統內的硫酸化酶將焦磷酸轉化成三磷酸腺苷(ATP)，熒光素酶利用ATP產生可檢測的熒光。如dNTP未能結合在DNA鏈上，則被反應體系內的ATP雙磷酸酶降解，不產生熒光，目前該方法已實現自動化，適合于高通量SNP的檢測。

8　SNP檢測方法的發展趨勢

一個理想的檢測SNP的方法必須具備以下優點:①適合自動化操作，簡便、迅速;②分析費用低，特殊試劑用量少;③即使不純的樣品也可得到可靠的結果;④數據分析簡單，易于自動化分析;⑤反應的通量要大而靈活，一天可以完成幾百到上百萬個樣品。目前報道的SNP檢測方法中，盡管有些方法成本低，但速度慢，且不適合自動化分析;有些方法可自動化高通量分析，但制備探針成本高，準確性低。到現在還沒有一個符合以上條件的理想方法出現，但根據樣品的實際情況，可以選擇出較合適方法。

綜上，靈敏準確、高通量、簡便易行的全基因組掃描分析方法對SNP的檢測特別重要，是未來SNP檢測的發展方向。目前的各種分析方法是通過發光、熒光、時間分辨熒光、熒光共振、熒光偏振、質譜、電磁學性質的探測使等位基因差異得以呈現，通過探針的設計和標記，研制光、熒光、電磁等探測SNP的儀器設備是實現SNP高通量檢測的關鍵。理想的分析方法必須依賴生物化學、工程學和分析軟件的共同進步。針對某些特異的基因片段改進或綜合已有的方法，可研究建立進行大規模高精度SNP檢測方法，如針對某些疾病設計的專一基因芯片等。可利用SNP及其衍生物的理化性質如光學、電學和磁學性質探索新的方法。利用電學性質進行檢測，把寡核苷酸放在固相支持物的電極上，當目標序列和互補的探針結合時，其探針的電學性質發生變化。用磁性標記物可以用于放大檢測信號。隨著相關科學技術的快速發展，有希望發展出一個理想的SNP檢測方法。

9　參考文獻

1 French DJ，Archard CL，Brown T，et al.HyBeacon probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination〔J〕．Mol Cell Probes，2001; 15(6) : 363-74.

2 French DJ，Archard CL，Andersen MT，et al.Ultra-rapid DNA analysis using HyBeacon probes and direct PCR amplification from saliva〔J〕．Mol Cell Probes，2002; 16(5) : 319-26.

3 Liu Q，Sommer SS.Detection of extremely rare alleles by bidirectional pyrophosphorolysis-activated polymerization allele-specific amplification(Bi-PAP-A) : measurement of mutation load in mammalian tissues〔J〕．Biotechniques，2004; 36(1) : 156-66.

4 Tournier I，Raux G，Di Fiore F，et al.Analysis of the allele-specific expression of the mismatch repair gene MLH1 using a simple DHPLC-Based Method〔J〕．Hum Mutat，2004; 23(4) : 379-84.

5 Myakishev MV，Khripin Y，Hu S，et al.High-throughput SNP genotyping by allele-specific PCR with universal energy-transfer-labeled primers〔J〕．Genome Res，2001; 11(1) : 163-9.

6 Sun X，Ding H，Hung K，et al.A new MALDI-TOF based mini-sequencing assay for genotyping of SNPS〔J〕．Nucleic Acids Res，2000; 28 (12) : E68.

7 Sun X，Guo B.Genotyping single-nucleotide polymorphisms by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight based mini-sequencing 〔J〕．Methods Mol Med，2006; 128: 225-30.

8 Iqbal F，Item CB，Ratschmann R，et al.Molecular analysis of guanidinoacetate-n-methyltransferase(GAMT) and creatine transporter(SLC6A8) gene by using denaturing high pressure liquid chromatography(DHPLC) as a possible source of human male infertility〔J〕．Pak J Pharm Sci，2011; 24(1) : 75-9.

9 Braun A，Little DP，K?ster H.Detecting CFTR gene mutations by using primer oligo base extension and mass spectrometry〔J〕．Clin Chem，1997;43(7) : 1151-8.

10 Griffin TJ，Hall JG，Prudent JR，et al.Direct genetic analysis by matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry〔J〕．Proc Natl Acad Sci U S A，1999; 96(11) : 6301-6.

11 Wise CA，Paris M，Morar B，et al.A standard protocol for single nucleotide primer extension in the human genome using matris-assisted laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry〔J〕．Rapid Commun Mass Spectrom，2003; 17(11) : 1195-202.

〔2013-12-17修回〕

(編輯安冉冉/杜娟)

基金項目:內蒙古自然科學基金杰青項目(2012JQ04) ;教育部科學技術研究重點項目(212026) ;中國科學院“西部之光”人才培養計劃項目

〔中圖分類號〕R394.3

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4720-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.146