錦鯉皰疹病毒病的研究進展

袁海延，于慧，王好，周井祥，張瑞雪，劉建平，馬躍，王釗

（吉林農業大學，長春130118）

錦鯉皰疹病毒病的研究進展

袁海延，于慧，王好，周井祥?，張瑞雪，劉建平，馬躍，王釗

（吉林農業大學，長春130118）

就錦鯉皰疹病毒病的病原學、流行病學特征、臨床癥狀、檢測方法和防治技術方面取得的成果進行了綜述，為研究和預防錦鯉皰疹病毒病提供參考。

錦鯉皰疹病毒；分子生物學；檢測方法；防治技術

錦鯉皰疹病毒病（Koi Herpesvirus Diease，KHVD）是由錦鯉皰疹病毒（Koi Herpesvirus，KHV）引起的一種高傳染性和高致死性的疾病，主要感染錦鯉、普通鯉魚及其變種。1998年首次從美國和以色列的患病鯉魚和錦鯉中分離出來并被證實。2001年香港首次爆發該疾病，最近已入侵了東南亞許多國家的初始種群。KHVD在2006年被世界動物衛生組織（OIE）列為必需報告的疾病［1］，但由于其發展史較短，有關KHVD的病原體、診斷方法及相關防疫措施的研究相對較少。本文就KHVD的研究進展進行了綜述，以期為錦鯉皰疹病毒病的后續研究提供參考。

1 病原體--KHV

1.1 KHV的分類和命名 最初由于KHVD臨床癥狀主要是腎臟出血紅腫和鰓壞死病變，被稱為鯉魚間質性腎炎和鰓壞死病毒（CNGV），后最終被命名為錦鯉皰疹病毒（KHV）［2］。KHV為皰疹病毒科（Herpesviridae），鯉皰疹病毒屬（Cyprinid herpesvirus），又稱鯉皰疹病毒3型（CyHV-3），與鯉痘瘡病毒（鯉皰疹病毒1型，CyHV-1）和金魚造血器官壞死病毒（鯉皰疹病毒2型，CyHV-2）同屬。KHV形態特征與其他兩種魚類皰疹病毒類似，但在臨床癥狀、宿主范圍、抗原性、生長特性和細胞病變類型等方面不同于二者［3］。

1.2 KHV分子生物學特性 KHV屬于皰疹病毒目（Herpesvirales）中的魚類皰疹病毒科（Alloherpesviri?dae）［4］，是一種較大的線性、雙鏈DNA病毒，基因組大小為295 kb，末端含有22個正向重復序列，共有156個開放性閱讀框（ORF）和8個末端重復序列，GC含量占全部核苷酸的59.2%。成熟的病毒粒子呈球形，直徑約為170～230 nm，主要由囊膜，皮層，衣殼，核心組成。核衣殼是直徑為110 nm左右的二十面體對稱結構，外有囊膜結構包裹。病毒核表面有螺紋結構，核內有一不對稱的電子致密區域，被認為是病毒基因組組成的核蛋白［5］。

1.3 KHV基因組結構的研究進展 目前，對KHV的主要基因型已經確定，其全基因組的結構及編碼蛋白的功能的研究較為滯后。僅個別較保守的ORF的功能已經確定，并被成功克隆。

1.3.1 結構蛋白 2010年，Michel B等人利用質譜的方法已確定KHV成熟病毒粒子由40種蛋白質組成，包括3個核衣殼蛋白（ORF72、ORF78、ORF92）、13個囊膜蛋白（ORF25、ORF32、ORF59、ORF65、ORF81、ORF99、ORF108、ORF115、ORF131、ORF132、ORF136、ORF148、ORF149）、2個間質蛋白（ORF62、ORF132）以及22個未分類蛋白［5］。但是只有個別基因經過試驗驗證其功能。2012年，李新偉克隆出編碼膜糖蛋白的ORF25和囊膜蛋白ORF81基因，并成功構建核酸疫苗［6］。ORF25表達蛋白存在于細胞質中，是KHV的主要結構蛋白，具有良好免疫原性［7］。ORF81［8］基因表達囊膜蛋白，含有四個跨膜區域，參與病毒與細胞融合及病毒對細胞的吸附、穿入和釋放。

1.3.2 非結構蛋白 根據蛋白質功能預測可分為5個家族：ORF2家族、TNFR（腫瘤壞死因子受體）家族、ORF22家族、ORF25家族和Ring家族。ORF2家族包括ORF2和ORF9，其中ORF2［9］基因表達膜蛋白。TNFR家族包括ORF4和ORF12。TNFR家族的兩個基因（ORF4／12）編碼的蛋白具有TNFRmotif.ORF25家族編碼6個膜蛋白（ORF25［6-7］、ORF26、ORF27、ORF65［7］，ORF148和ORF149）；RING家族共編碼四個蛋白（ORF41、ORF128、ORF144、ORF150）均含有鋅指結構（RING Finger）特征基序。

KHV的主要毒力基因可能為TK基因［10］，對應ORF55，編碼胸腺嘧啶脫氧核苷激酶。其功能為催化脫氧胸腺嘧啶核苷酸化成dTMP，并進一步磷酸化為dTTP，即組成DNA分子的基本成分，此外也間接參與dCTP、dGTP和dATP等物質的合成。與病毒在宿主體內保持潛伏感染狀態以及激活潛伏感染狀態密切相關，具有關鍵性的作用。

KHV的免疫原性蛋白5個［11］，分別為ORF56、ORF150、ORF92、ORF22和ORF23.其中ORF56為糖蛋白，ORF150為RING家族脂蛋白，ORF92為主要衣殼蛋白，ORF22為膜蛋白，ORF23編碼白介素-10。這些免疫調節基因是保守的，并且可以在逃避宿主免疫系統的病毒的能力中起重要作用。

2 KHVD流行病學特征

KHV感染造成錦鯉和普通鯉魚的重大死亡。這種疾病早前在以色列被稱為鯉魚間質性腎炎和鰓壞死的疾病（CNGV）。錦鯉皰疹病毒首次于1998年在以色列和德國爆發。隨后在美國、英格蘭和荷蘭爆發被報道［1］。2002年，首次在中國廣東省發現該病［12］。2011年，朱霞等利用框鏡鯉魚鰭細胞（KFC）從我國遼寧省某養殖的患病錦鯉分離得到該病毒［13］。如今KHVD現已蔓延到大多數大洲，至今為止，超過30多個國家或地區爆發該病，包括以色列、英國、德國、美國南非、波蘭［14］、捷克共和國［15］、日本［16］、澳大利亞、韓國［17］、馬來西亞、中國［18］、加拿大［9］、俄羅斯［20］、新加坡以及印度等。

KHVD感染宿主的范圍比較窄，目前只發現易感染錦鯉、鯉魚及其變種魚。幼魚與成魚均易感染。一般疾病的潛伏期5～7 d，特點是當水溫在15～25℃范圍內，突然發病，迅速蔓延［21］。KHVD發病最適溫度為20～25℃，30℃以上病毒會處于休眠狀態，最新研究發現KHV可以在冰下繁殖，發病時水溫為-2～5℃，平均3℃［22］。KHV爆發后幸存的魚帶毒，可將疾病傳染給其他魚。

3 KHVD臨床癥狀

感染KHV后的錦鯉或鯉魚的臨床癥狀與病程有關，處于不同時期的患病魚的癥狀有差異。在感染初期，體表有少量出血點和白斑，鱗片松動，脫落并帶有血絲；肛門略微紅腫；眼凹陷，眼底出血；鰭條充血，尾鰭最為嚴重，臀鰭和背鰭次之；皮下和肌肉出血；打開鰓蓋，鰓絲呈深紅色，減去一條全鰓，血流量減少且凝固迅速；腸道充血發紅且硬挺，腎腫大顏色發紅，脾臟有出血點，膽汁的顏色較深。感染中后期出現精神抑郁，行動遲緩且無方向感的游泳或停止游泳，皮膚出血及出現白斑和水泡，鰭條上有血絲，鰓蓋和鰓絲出血并產生大量粘液，患病魚在1～2 d內死亡。KHV發病時，出現發病急，感染率和死亡率高等特點，且容易死亡的常是體態肥碩的［3］。

4 檢測方法研究進展

由于KHV傳播快，感染率和死亡率高，潛伏時間長，所以需要研究出能快速準確的診斷KHV的辦法以便對魚群及時有效的處理從而控制KHV的傳播。通過常規的臨床診斷不能對錦鯉皰疹病毒病進行確診，還需結合試驗技術診斷方法。迄今為止，許多技術已被用于魚錦鯉皰疹病毒的檢測［23］。目前主要的診斷方法有細胞分離培養檢測、血清中和試驗和分子生物學檢測。

4.1 細胞分離培養 該病毒可在易感的魚類細胞分離，如KFC、KF-1、KT-2或CCB的細胞株。目前，國內KHV細胞分離培養技術已經相當成熟。2011年，中國中山大學何建國等人建立了一種鯉魚鰭條細胞系KCF-1，并成功分離得到了KHV［24］。同一年，吉林農業大學朱霞等人也成功的分離得到了KHV［25］。

4.2 分子生物學診斷方法

4.2.1 PCR技術 PCR是KHV檢測的一種更具體和敏感的方法，Nested-PCR［13］、實時PCR［26］、熒光定量PCR［27］已經開發使用于錦鯉皰疹病毒的檢測。由于KHV含有內含子，所以設計跨越內含子區域的引物，使用RT-PCR［28］方法也可以準確的鑒定該疾病。但是PCR方法不能用于活魚檢測。

4.2.2 環介導等溫擴增（LAMP） 經過不斷地改良，LAMP法的敏感度和特異性越來越高。最近，Wen-Hsin等［29］建立了一個在集成微流體系中，運用LAMP法快速分離和檢測水產病原的工具。該工具可以在65 min內完成樣品前處理，LAMP程序及光學檢測的全過程，可以同時檢測四種病原體。因此，LAMP在未來可能成為快速檢測KHV的有力工具。

除了上述方法外還有ELISA方法、電鏡技術及原位雜交技術等。ELISA方法是一種間接診斷方法，可以通過檢測錦鯉和鯉魚血清中抗KHV抗體來診斷。但是，ELISA方法檢測KHV的背景值高，與CCV和CHV之間具有較高的交叉免疫反應。另外，魚類的血清抗體水平較低，不易檢出，因此ELISA的應用受到了一定的限制。電鏡技術及原位雜交技術所需要儀器設備非常昂貴，不適宜推廣應用。

5 防控措施

KHVD給世界各地的鯉魚和錦鯉養殖業都造成了嚴重的經濟損失，而且一旦爆發，病情很難控制。及時采取有效的預防措施是控制該病的主要途徑。

5.1 免疫預防 防制病毒性傳染病的有效方法是疫苗免疫。目前減毒疫苗、滅活苗、核酸疫苗已經投入使用。減毒疫苗對魚的免疫保護作用可維持至少8個月，目前已經商業化生產。滅活苗還沒有商業化生產。

由于滅活疫苗和減毒疫苗在穩定性、成本及保護率方面還有許多缺點，所以核酸疫苗應運而生，通常通過克隆KHV某段序列并構建真核表達重組質粒，然后免疫試驗動物而獲得的特異性抗體。滅活疫苗和減毒疫苗無法誘導機體產生細胞免疫。而核酸疫苗不僅可以誘導機體產生細胞免疫，且保護力持續時間較長。到現在為止，仍沒有可靠地核酸疫苗產生。Fuchs等［30］人生產的具有刪除病毒核糖核苷酸還原酶（RNR）、胸苷激酶（TK）、尿嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸酶（dUTPase）、或刪除TK和dUTP基因的重組KHV。所有的病毒突變株在培養細胞中均有復制能力，但TK或dUTP缺失株空斑變小，滴度降低，對鯉魚感染力衰減。所以構建的TK或dUTP缺失株對于KHV的防控有很大的借鑒意義，可以進一步研究KHV基因缺失疫苗。

5.2 其他防控方法 有研究［31］認為，KHVD的流行是季節性水溫變化導致的，由此提出爆發的控制可以通過控制養殖中的水溫來實現，還可以通過篩選對KHV有抵抗力的雜交種和品系來降低由KHVD造成的損失，但該方法不適用于篩選有KHV抗性的觀賞錦鯉。

6 展望

當前，KHVD已經嚴重的威脅到了鯉魚養殖業，關于KHVD急需多方面深入研究，如生物學及分子生物學的深入研究、基因組每個基因功能的確定、診斷方法的研究、敏感細胞系的建立和研制有效的疫苗等。

目前，在我國關于KHVD爆發的報道并不多見。但是我們必須提高警惕，盡快建立特異、敏感、快速、適宜現場診斷的方法，加強進出口口岸檢疫，控制KHVD在國內的傳播，避免KHVD對鯉魚養殖業造成巨大損失。

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（編輯：李文平）

Research Progress of Koi Herpesvirus Disease

YUAN Hai-yan，YU Hui，WANG Hao，ZHOU Jing-xiang?，ZHANG Rui-xue，LIU Jian-ping，MA Yue，WANG Zhao
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

The achievements of etiology，epidemiological characteristics，clinical symptoms，detection method，the prevention and control technology for the koi herpesvirus disease were summarized to provide a reference for research and prevention of koi herpesvirus disease.

koi herpesvirus；molecular biology；detection method；prevention and control technology

2015-01-16

A

1002-1280（2015）05-0062-04

S943

袁海延，碩士研究生，從事動物病毒分子生物學研究。

周井祥。E-mail：zhjxnd＠126.com