帕金森病動物模型評價及發病機制探討

·綜述·

帕金森病動物模型評價及發病機制探討

張淑香，田偉，任燕冬，李玉萍，劉樹民

(黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)也稱震顫麻痹，是中老年人常見的神經系統變性疾病。目前65歲以上人群患病率達1.2‰，隨年齡增高，男性稍多于女性。PD的主要臨床特征為靜止性震顫、動作遲緩及減少、肌張力增高等，并呈進行性加重[1]，嚴重限制病人的活動能力及影響病人的生活質量。其病理改變主要為黑質和紋狀體多巴胺(DA)能神經元變性缺失，紋狀體DA遞質減少，細胞內嗜酸性路易小體(LB)形成。但其確切的發病機制尚不十分明確，因此，PD至今仍無有效的治療措施，而有效的帕金森病動物模型的建立和應用是解釋其發病機制及新藥開發的關鍵。因此，本文就帕金森病動物模型及其發病機制作一概述，為闡明帕金森病發病機制及藥物開發奠定基礎。

1帕金森病動物模型

1.1神經毒素模型

1.1.16-羥多巴胺(6-OHDA)模型此模型是由Ungerstedt的團隊首次建立，產生機制主要是6-OHDA在體內是通過形成羥自由基和抑制線粒體氧化呼吸鏈復合物I和IV，干擾ATP合成，選擇性引起DA能神經元死亡而產生與PD臨床特征相近的癥狀。此模型不足之處在于操作復雜且模型動物選擇上有一定的局限性，最適合大鼠。6-OHDA不能通過血腦屏障，因此造模時需麻醉、手術將其注入動物腦內，所以此模型不適合體積較小的動物(例如小鼠)。模型成功率與注射部位及注射角度密切相關。注射部位主要有黑質、前腦內側束以及紋狀體，注射方法有單側單點注射[2]，還有雙側多位點注射[3]，尤以多位點注射效果更佳。另外是此模型不產生真正的Lewy體，故無法準確評價其模型作用。多方綜合評價，此模型不是最理想的PD動物模型。

1.1.2MPTP模型此模型與線粒體功能障礙密切相關。其機制是MPTP在腦內與單胺氧化酶B結合，變成活性物質甲基苯基吡啶離子(MPP+)。MPP+被DA神經元轉運體主動攝取到其線粒體內，從而抑制線粒體復合物I的活性，導致DA能神經元變性、凋亡[4]。MPTP有高度脂溶性且易透過血腦屏障，所以此模型操作較簡單(腹腔注射)，其指標與臨床表征相似度較高。王茜等[5]采用腹腔注射MPTP方法建立了C57BL/6N小鼠PD模型，并運用免疫組織化學和免疫蛋白印跡等技術對紋狀體黑質酪氨酸羥化酶、磷酸化P38、NF-κB和iNOS的表達進行了考察，行為學檢測結果顯示，模型組小鼠出現動作緩慢、豎毛等典型的PD癥狀，黑質TH陽性神經元和蛋白水平也顯著減少。MPTP模型是目前最理想的PD動物模型之一，已被廣泛的應用于PD的實驗研究中。

1.1.3魚藤酮模型魚藤酮是一種殺蟲劑，對中樞DA神經系統有損傷作用，有實驗采用背部皮下注射魚藤酮的方法建立PD動物模型，結果發現經魚藤酮處理的大鼠出現明顯的行為學變化，顯示出典型的帕金森病特征[6]。由于魚藤酮毒性較大，所以此模型存在制作復雜，死亡率高的缺點，可通過低劑量長時間皮下注射魚藤酮，來成功建立PD大鼠模型。魚藤酮模型能較好地模擬PD的慢性進行性病程和發病特點，已被廣泛用于PD發病機制和治療的研究[7-8]。

1.1.4其他除草劑(百枯草)模型因為除草劑暴露方式與實際環境因素仍有一定的差距，故需對其進一步研究。孫亞奇[9]利用載體PD95.86建立了秀麗線蟲PD模型，對α-synuclein過表達致使秀麗線蟲中毒的作用進行考察。該研究發現，與正常組比較α-synuclein轉基因線蟲的壽命明顯縮短，運動能力顯著下降，生命活力減弱，出現PD病理特征，此模型的毒性效應機制還不十分明確，仍需進一步研究。

1.2遺傳基因模型

1.2.1轉基因模型高寧等[10]建立了α-synuclein野生型和突變型兩種轉基因動物模型，通過顯微鏡注射的方法制備α-synuclein基因的轉基因小鼠，并且鑒定其轉基因首代和子代的基因型，最終得出結論：在轉基因小鼠的大腦的海馬區發現了α-synuclein陽性標記的細胞，雖未出現特征性的Lewy體聚集，但出現行為學上的改變，說明轉基因模型建立成功。此模型在探索PD發病機制上有著重大應用前景。

1.2.2基因剔除模型目前已經明確Parkin、PINK1、Nurr1、DJ-1、HtrA2/Omi等基因與PD發病相關[11-12]，并且這些類型的基因模型與人類PD的病理特征表現上相似度極高，并且操作簡便，因此可以作為藥物篩選的良好模型，具有很好的研究價值。

1.3藥物模型利血平屬于腎上腺素能神經抑制藥，對多巴胺神經元有抑制作用，而多巴胺神經元可以分泌大量的多巴胺，利血平可與囊泡轉運體識別位點進行不可逆結合，導致囊內多巴胺降解代謝出毒性物質，致使細胞內p53高度表達，并損傷細胞內活性物質，進而誘導細胞大量凋亡，最終出現靜止性震顫、運動遲緩等與PD相似癥狀[13]。但大量服用利血平會產生藥物毒性，因此不是PD的常見模型。

2帕金森病發病機制

2.1遺傳因素

2.1.1α-突觸核蛋白基因α-synuclein是一種構成Lewy body的蛋白質，主要在中樞神經突觸前表達，它主要位于突觸前神經末梢和細胞核內，在腦內許多部位均有表達，由于α-synuclein基因會與Fe2+等離子發生交互作用，產生α-synuclein家族性點突變，從而誘發常染色體顯性遺傳家族性帕金森病。劉鵬等[14]建立了α-synuclein基因動物模型，并采用Western blotting和實時熒光定量PCR技術進行分析，實驗結果表明：模型組小鼠與空白組小鼠相比其GRK5的mRNA和蛋白水平均有所增加，α-synuclein基因對中樞神經系統有明顯的作用，進而推論α-synuclein基因與帕金森病發病有著密切的聯系。

2.1.2帕金森蛋白(parkin)基因Parkin基因主要分布于正常大腦組織的黑質區，是常染色體隱性遺傳性少年型帕金森病的致病基因，Parkin蛋白是其主要產物，具有E3泛素-蛋白連接酶活性的作用，并且可阻斷泛素—蛋白水解酶復合體通路。其導致帕金森病的發病機制可能是由于Parkin的過度表達，增強了底物蛋白的泛素化，使其加速降解，產生細胞毒性，最終導致多巴胺神經元的正常功能受損[15-16]。

2.1.3泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)基因UCH-L1屬于去泛素化酶家族，是腦內含量最豐富的蛋白質之一，具有調節細胞內多種蛋白質降解的作用。研究表明UCH-L1基因突變可抑制UCH-L1的活性，使中腦多巴胺能神經元發生變性，蛋白水解通路及泛素循環通路發生異常，細胞內泛素大量聚集，從而導致神經元受損甚至變性。

2.1.4DJ-1基因DJ- 1基因是肽酶C56蛋白質家族的一員，主要參與機體內的氧化應激過程，保護神經元免受氧化應激的影響。當DJ- 1基因發生突變后，可增加氧化應激對神經元的損害作用。DJ- 1基因突變會導致常染色體隱性遺傳早發性帕金森癥。孫雙勇等[17]通過建立MPTP小鼠模型，采用側腦室注射的方法，觀察DJ- 1對MPTP致帕金森病小鼠的神經保護作用，結果表明側腦室注射DJ-1蛋白后，PD小鼠的行為學有明顯改善。從而說明DJ-1對PD小鼠神經系統有一定保護作用。

2.2環境致病因素許多研究表明與MPTP相似的一些毒性物質可能對PD發病有一定影響。研究發現當進入人體內的毒素原MPTP經B型單胺氧化酶(MAO-B)的催化可轉化為活性代謝產物—MPP+，MPP+將破壞線粒體呼吸鏈上的復合體及電子傳遞，從而導致神經細胞至凋亡[18]。有研究采用MPTP為PD動物模型，探究猴腦內葡糖代謝情況，發現葡萄糖代謝顯著降低，此外隨MPTP濃度增大其毒性增強[19]。

2.3細胞功能障礙

2.3.1氧化應激氧化應激在帕金森病中起著重要作用，實驗表明帕金森病大鼠右側紋狀體內的谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)抗氧化物質的活性顯著降低，其機制可能是脂質過氧化增強的結果[20]。程偉平等通過建立MPTP小鼠PD模型的方法，觀察帕金森病小鼠腦內GSH及GSH-PX的影響及行為學變化，實驗發現在PD小鼠黑質GSH含量增加，GSH-PX活性增強，并且出現PS行為學特征[21-22]。

2.3.2線粒體功能障礙線粒體是細胞中主要產生能量(ATP)的細胞器，被稱為“細胞動力工廠”，大量研究發現帕金森病患者腦組織內的線粒體酶復合體功能出現障礙，線粒體酶復合體I活性降低，從而產生PD樣癥狀[23]。目前發現的致病基因有DJ-1基因和PINK1基因，PINK1基因通過磷酸化Parkin并維持其連接酶活性，從而與PD的發病機制相關[24]。

2.3.3蛋白質表達異常α-synuclein在腦組織中的含量最多，它的異常聚集是Lewy體形成的主要標志，研究發現當大鼠中腦的α-synuclein水平升高時，中腦的黑質多巴胺能神經元和紋狀體多巴胺有缺失和下降的趨勢，α-synuclein在帕金森患者體內異常增多可能導致多巴胺能神經元失活甚至凋亡。此外，α-synuclein還可以與Parkin相互作用，但其作用結果尚無定論[25]。

2.4興奮性神經毒性作用興奮性氨基酸(EAA)對神經細胞的毒性病理機制已成為人們關注的焦點，特別是在腦缺血、腦外傷、癲癇的病理過程中起著重要作用，L-谷氨酸和L-天門冬氨酸作為興奮性氨基酸的主要代表物，研究表明其毒性作用可能與DA能神經元受損有關。如果興奮性氨基酸將產生神經細胞毒性。它們的主要毒性機制可能與紋狀體內谷氨酸的變化和多巴胺分泌有關[26]。

2.5年齡老化的協同促進作用年齡的老化是PD發病的危險因素之一。研究發現隨年齡不斷增長，人類腦內的黑質DA能神經元、紋狀體DA遞質將逐年減少，DAD1和D2受體密度逐漸減低。但老年人患PD的人數并不是很多，說明正常生理性的DA能神經元退變不足以引起PD。耿全現[27]將84例非癡呆帕金森病患者分成早期患者(年輕、老人)和晚期患者(年輕、老人)兩個段，測定他們的認知障礙，結果發現年齡大的患者認知障礙有所下降，疾病晚期患者的認知障礙也有所下降，但是下降趨勢并不十分明顯。因此我們得出結論，年齡老化在PD的發病中只是一個協同因素，其可能與其他因素共同導致PD發病。

3結語

綜上所述，以上帕金森病動物模型能夠較全面地反映PD病因及發病機制、病理特點，使我們對PD的發病機制有了進一步的了解，但目前所發現的PD動物模型與人類PD發病特征還有一定的差距，尤其在震顫方面，以上模型均不能較好體現，因此建立理想的PD動物模型還有待進一步的探索。就目前的研究發現PD發病機制是多因素、多基因相互協同的作用，至今仍沒有明確的解釋，但隨著人們對PD模型的不斷的開發與探索，相信PD的病理機制及其臨床治療研究將會有重大進步。

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(收稿日期:2015-02-06)

通信作者：劉樹民，博士，教授，博士生導師，Email：keji-liu@163.com

作者簡介：張淑香，博士，副研究員，Email：zsxiang1010@163.com

基金項目：國家自然科學基金青年基金(81303249)；黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531637)；黑龍江省博士后資助項目(LBH-Z11017)

中圖分類號：R742.5

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.04.041