NO參與調節高濃度CO2誘導的番茄氣孔關閉

王 歡， 肖文丹， 牛耀芳， 柴如山， 劉 秒， 章永松

(浙江大學環境與資源學院，環境修復與生態健康教育部重點實驗室，杭州 310058)

NO參與調節高濃度CO2誘導的番茄氣孔關閉

王 歡， 肖文丹， 牛耀芳， 柴如山， 劉 秒， 章永松*

(浙江大學環境與資源學院，環境修復與生態健康教育部重點實驗室，杭州 310058)

【目的】高濃度CO2在促進植物光合作用的同時，也誘導了葉片氣孔關閉。氣孔關閉降低植物的蒸騰作用，有助于提高水分利用效率和耐旱性。本文研究了高濃度CO2對番茄氣孔開度和保衛細胞中一氧化氮(NO)含量的影響，以及NO信號分子在高濃度CO2誘導番茄氣孔關閉的信號轉導機制中的作用。為了確定NO的酶催化途徑，本試驗檢測了一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)在高濃度CO2促進NO合成中的作用?！痉椒ā勘驹囼炓苑?SolanumlycocarpumL.)為研究材料，利用CO2培養箱(Conviron E7/2 growth chambers)提供不同CO2濃度的試驗環境 (將培養箱中CO2濃度控制為350 μL/L或800 μL/L)，研究不同CO2濃度和試劑處理對番茄氣孔開度和保衛細胞中NO含量的影響。采用NO特異性熒光探針DAF-FM DA檢測番茄保衛細胞中NO的含量。DAF-FM DA與NO反應生成一種熒光物質DAF-2 T，根據其熒光強度的高低可以判斷NO的相對含量。利用NOS抑制劑L-NAME和NR抑制劑鎢酸鹽(tungstate)，分別研究了NOS和NR在高濃度CO2促進NO合成中的作用?！窘Y果】高濃度CO2處理6 h后，番茄氣孔開度降至2.3 μm，較正常氣孔開度降低了32%。NO熒光法檢測發現，高濃度CO2處理導致保衛細胞的熒光強度顯著增加，熒光強度升高了88%。當使用cPTIO清除NO后，保衛細胞中NO含量降低了35 %；氣孔開度恢復至3.2μm，基本上達到正常濃度CO2處理下的氣孔開度。在高濃度CO2下，200 μmol/L L-NAME處理導致氣孔開度增加了30 %，保衛細胞中NO含量降低了33%；100 μmol/L鎢酸鹽處理導致氣孔開度增加了35 %，保衛細胞中NO含量降低了40%?！窘Y論】本文發現高濃度CO2顯著提高保衛細胞中NO含量和誘導氣孔關閉，清除NO后則明顯抑制氣孔關閉，表明NO在誘導氣孔關閉過程中起重要作用。藥理學實驗顯示，使用NOS抑制劑L-NAME和NR抑制劑鎢酸鹽均可顯著降低NO含量和抑制氣孔關閉，表明NOS和NR均參與了高濃度CO2誘導保衛細胞中NO的合成過程。因此，認為高濃度CO2通過NOS和NR路徑促進保衛細胞中NO的合成，提高了保衛細胞中NO含量，從而誘導了番茄氣孔關閉。

高濃度CO2； 氣孔； 一氧化氮； 番茄； 一氧化氮合成酶； 硝酸還原酶

自18 世紀工業革命以來，由于人類燃燒化石燃料和大量砍伐森林的影響，大氣CO2濃度不斷升高，從工業革命前的270 μL/L上升到目前的350 μL/L，并且預測到本世紀末，大氣CO2濃度將升高到730～1020 μL/L[1]。近期研究證明，大氣CO2濃度升高可增強植物的光合作用[2]，促進側根和根毛的形成[3-4]以及植物葉片的生長和發育等[5]，其中一個重要的方面是大氣CO2濃度升高對植物氣孔的密度、導度和運動等帶來明顯影響[6]。氣孔是植物表皮上的微小孔隙，一般直接由兩個豆狀的保衛細胞組成。這兩個細胞的端部相連，其中靠近氣孔的細胞壁厚，伸縮性弱；遠離氣孔的細胞壁薄，伸縮性強。細胞中部之間的空隙是葉片內部與大氣之間的通道[7]。事實上，多種環境因素可以引起植物氣孔開度的變化，如水分虧缺、光照、濕度、疾病感染、CO2濃度等[8]。氣孔開度的變化是植物平衡光合作用和水分利用效率的一種重要方式[9]。Betts等[5]指出高濃度CO2導致氣孔開度減小，從而降低植物的蒸騰作用，可以使更多的水分留在土壤中，增強植物耐旱性。然而，高濃度CO2誘導植物氣孔關閉的機理并不清楚。

眾多證據顯示，一氧化氮(NO)作為一種氣體信號分子，在植物生理過程中發揮著重要作用，如植物的生長和發育[10-11]、氣孔的運動[12]、植物對生物和非生物脅迫的響應等[13-14]。NO的多種功能源于其與眾多信號途徑密切相關，這些信號途徑包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、生長素(auxin)、水楊酸(salicylic acid, SA)、促有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Ca2+等[12, 15]。已有研究表明，脫落酸(ABA)通過調控保衛細胞中ROS、NO的合成與含量誘導氣孔關閉[16-18]。在此過程中，ROS和NO均誘導了下游的鈣離子信號，導致細胞質鈣離子濃度[Ca2+]i升高。Prior等[19]研究發現，高濃度CO2顯著增強植物對氮、磷、鉀、鈣、鎂和微量元素銅、鐵、錳、鋅的吸收能力，從而提高保衛細胞中的[Ca2+]i濃度。作者在近期的研究中也發現，NO信號分子在高濃度CO2促進番茄側根的發育和形成過程中起著重要作用[3]。因此推測，NO信號分子在高濃度CO2誘導氣孔關閉過程中也可能發揮主要作用。然而，具體的信號傳導過程和調控機理尚不清楚。

在生物體內，NO的合成途徑有很多，包括酶催化途徑和非酶催化途徑，但在不同的生物體內和環境下，NO的來源有著顯著差異。在動物體內，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是合成NO的主要來源，以L-精氨酸(L-arginine)為底物，在NADPH和氧存在條件下經過5個電子的氧化生成L-瓜氨酸(L-citrulline)和NO[20]。在植物體內，酶催化途徑合成NO的主要酶包括NOS和硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)，以及在某些植物的特定組織或器官或在特殊環境條件下存在的一氧化氮氧化還原酶(nitric oxide oxidoreductase，N-iNOR)和黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase, XOR)[21]。雖然到現在還沒有鑒定出植物NOS基因和酶蛋白的同源體，但使用動物NOS抑制劑仍能抑制NO的合成，說明在植物體內仍存在依賴L-精氨酸的NOS活性[22]。Corpas等[23]的研究證明，豌豆幼苗的葉片、莖和根中存在組成型NOS活性，并且不同的部位和發育階段組成型NOS活性不同。Neill等[24]報道，ABA誘導的NO濃度升高在擬南芥氣孔關閉中起重要作用，而且NO主要是通過NOS-like途徑產生。Guo等[25]運用轉基因技術將T-DNA插入到AtNOS1內構建atnos1突變體，證明了NOS對于線粒體中NO合成和ABA誘導氣孔關閉是必需的。使用ABA處理葉片表皮后發現，與野生型相比，atnos1突變體中的ABA誘導氣孔關閉和保衛細胞中NO含量升高均受到了強烈抑制。最近研究發現，高濃度CO2增強番茄根中NOS活性，從而促進了NO的合成和側根的形成[3]。

在植物體內還存在另外一種催化NO合成的酶蛋白—硝酸還原酶(NR)。不管采用植物體內法還是體外法試驗，NR均能利用NAD(P)H作為電子供體催化亞硝酸鹽還原生成NO[12, 26]。Desikan等[17]運用擬南芥NR雙突變體nia1nia2 (擬南芥nia1nia2突變體中NR酶活性不到野生型的1 %)研究發現，ABA不能誘導nia1nia2突變體保衛細胞中NO合成和氣孔關閉，說明NR介導NO的合成是保衛細胞中ABA信號的重要步驟。Bright等[16]研究發現，NR抑制劑鎢酸鹽(如鎢酸鈉)抑制ABA和亞硝酸誘導的氣孔關閉和NO產生。目前，關于高濃度CO2對NR酶活性的影響，以及NR在植物對高濃度CO2響應中的作用尚未形成一致的觀點。一些學者認為，高濃度CO2增強了大車前草(Plantagomajor)和煙草(tobacco)體內的NR酶活性[27-28]；而Ferrario-Méry等[29]研究表明，高濃度CO2降低了小麥、玉米和煙草體內的NR酶活性。最近本課題組研究發現，高濃度CO2對番茄體內NR酶活性沒有顯著影響[3]。這種差異性可能與不同的植物品種、組織部分、發育階段和生長條件等因素有關。

本文利用CO2培養箱(Conviron E7/2 growth chambers)提供不同CO2濃度的試驗環境，研究了NO信號分子在番茄氣孔對高濃度CO2響應中的作用以及NO來源，以期進一步揭示高濃度CO2誘導番茄氣孔關閉的內在機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以番茄(SolanumlycocarpumL.)為研究材料。種子經滅菌消毒后，均勻撒于含0.8 %(w/v)瓊脂和1.0%(w/v)蔗糖的全營養培養基上，然后在4℃黑暗下春化24 h后，將培養皿放在擬南芥培養室發芽。培養7 d后，挑選長相一致的壯苗移栽到1/2濃度的全營養液中培養14 d，選擇長相一致的壯苗移栽至裝有全營養液的黑色塑料燒杯中(約300 mL)。營養液的組成如下(μmol/L): H3BO310、 MnSO40.5、ZnSO40.5、 CuSO40.1、(NH4)6Mo7O240.1、 Fe-EDTA 25、 KH2PO4500、MgSO4500、 CaCl21000、 KNO31500。營養液pH值調節為5.8～6.0，每隔3 d更換一次。所有植物放在人工氣候室內培養，室內植物生長條件為: 相對濕度為70%～80%，光照強度photons 200 μmol/L/(m2·s)，光照晝夜循環為白天10 h/夜晚14 h，白天/夜晚氣溫分別為22℃/20℃。繼續培養14 d后，幼苗用于以下處理與測定。

1.2 氣孔開度的測定

氣孔開度的測定采用McAinsh等[30]方法，并作微小改動。撕下番茄葉片的下表皮并使其漂浮在3 mL MES緩沖液上。MES緩沖液組成為10 mmol/L MES-KOH、 5 mmol/ L KCl、 50 μmol/L CaCl2, 并維持pH為6.15不變。為了使氣孔全部開放，表皮在22℃、 photon 200 μmol/L/(m2·s)光照條件下處理2 h。然后，放入不同濃度的CO2培養箱(Conviron E7/2 growth chambers)中，將培養箱中CO2濃度控制為350 μL/ L(正常濃度CO2)和800 μL/ L(高濃度CO2)兩個水平。在不同CO2濃度下，使用下列試劑單獨或復合處理下表皮: 200 μmol/ L NO清除劑cPTIO[2-(4-carboxyphenyl)-4,4，5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide]; 100 μmol/ L NO供體SNP(sodium nitroprusside); NOS抑制劑L-NAME; NR抑制劑鎢酸鹽(tungstate)，其中L-NAME和鎢酸鹽的濃度通過試驗確定。6 h后，使用帶數碼照相機的光學顯微鏡觀察氣孔大小并拍照。使用ImageJ軟件分析照片，測量氣孔開度。為了避免晝夜節律作用對氣孔運動的影響，所有試驗處理均在相同的時間段內進行。每個處理重復6次，每次測量8～10個氣孔。

1.3 保衛細胞中NO含量的測定

本試驗使用NO特異性熒光探針DAF-FM DA(4-amino-5-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate)測定保衛細胞中NO含量[31]。撕下番茄葉片下表皮放在含10 μmol/L DAF-FM DA的MES緩沖液(pH 6.15)中，在黑暗中處理30 min后，用不含染色劑的MES緩沖液清洗下表皮除去多余的染色劑。在正常濃度CO2或者高濃度CO2培養箱中經不同處理6 h后，使用激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscope, CLSM)檢測熒光物質的熒光強度，激發光和發射光的波長分別為488和515 nm。使用顯微鏡上的數碼照相機拍攝熒光照片，并用ImageJ軟件分析熒光強度。熒光強度用相對光強單位表示，范圍為0～255。

1.4 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel(2007)和SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，LSD法比較不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 高濃度CO2對番茄氣孔關閉的誘導作用

Webb等[32]報道，CO2濃度升高誘導鴨跖草保衛細胞中[Ca2+]i濃度升高，從而誘導氣孔關閉。筆者通過測定高濃度CO2不同處理時間下氣孔開度的變化，在番茄中也發現了類似的氣孔關閉現象。從圖1可以看出，高濃度CO2處理番茄下表皮2 h后，氣孔開度由3.2 μm降低至2.7 μm，下降了16%，達到顯著水平(P<0.05)。高濃度CO2處理6 h后，氣孔開度達到最小為2.3 μm，較正常氣孔開度降低了32 %，隨后氣孔開度略有升高。因此，在以后的試驗中，正常濃度CO2和高濃度CO2的處理時間均采用6 h。本試驗結果表明，高濃度CO2處理誘導了番茄氣孔關閉，顯著降低氣孔開度。植物氣孔關閉可以降低蒸騰作用，增強植物的耐旱性，提高水分利用效率。

2.2 NO在高濃度CO2誘導氣孔關閉中的作用

[注(Note): A表示CO2濃度為350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2濃度為800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment.]

已有研究表明，NO信號分子在ABA誘導氣孔關閉過程中起著重要作用[11]。為了研究NO在高濃度CO2誘導氣孔關閉過程中的作用，本試驗采用了NO供體SNP和NO清除劑cPTIO調節番茄保衛細胞中NO水平。如圖2所示，正常濃度CO2處理下，在緩沖液中加入SNP后導致氣孔開度降低至2.1 μm，降低了38 %。高濃度CO2處理下，在緩沖液中加入cPTIO清除保衛細胞中NO后，氣孔開度恢復至3.2 μm，基本上達到正常濃度CO2處理下的氣孔開度，表明cPTIO通過清除NO抑制了高濃度CO2誘導的氣孔關閉。在緩沖液中同時加入SNP后，氣孔開度降低至2.4 μm，表明SNP解除了cPTIO的抑制作用，恢復了高濃度CO2誘導氣孔關閉的調控。由此可以推斷NO信號分子參與了高濃度CO2誘導番茄氣孔關閉的過程。

為了直接檢驗NO在高濃度CO2誘導氣孔關閉過程中的作用，本試驗使用了NO熒光探針DAF-FM DA測定保衛細胞中NO的相對含量。DAF-FM DA與NO反應生成一種熒光物質DAF-2 T，根據其熒光強度的高低可以判斷NO的相對含量。在正常濃度CO2處理下，SNP水溶液釋放NO顯著提高了保衛細胞的熒光強度，熒光強度增加了119%(圖2)。與正常濃度CO2處理相比，高濃度CO2處理導致保衛細胞的熒光強度顯著增加，熒光強度升高了88%。當使用cPTIO清除NO后，保衛細胞的熒光強度顯著降低了35%。然而，cPTIO對NO的清除作用可大部分被SNP解除。因此認為，高濃度CO2處理增強了保衛細胞合成NO的能力，提高了保衛細胞中NO含量，從而誘導番茄氣孔關閉。

2.3 NOS參與高濃度CO2促進保衛細胞NO合成的過程

[注(Note): A表示CO2濃度為350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2濃度為800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment; S表示SNP Indicate SNP treatment; C表示cPTIO Indicate cPTIO treatment.柱上不同小寫字母表示不同處理間差異達到5%顯著水平 Different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

在植物體內，NOS是組成型NO合成路徑中重要的催化酶之一。本試驗利用NOS抑制劑L-NAME檢測了NOS在高濃度CO2促進保衛細胞NO合成中的作用。圖3為在高濃度CO2下不同L-NAME濃度處理對氣孔開度影響的結果，從中可以看出，當L-NAME濃度為200 μmol/L時，高濃度CO2誘導的氣孔開度恢復至3.0 μm，達到最大水平。因此，在之后的試驗中，L-NAME濃度均采用200 μmol/L。

在高濃度CO2下，L-NAME處理導致氣孔開度增加了30 %，保衛細胞熒光強度降低了33 %(圖4)。然而在正常濃度CO2下，L-NAME處理對氣孔開度沒有顯著影響，對保衛細胞熒光強度影響較小。此外，SNP處理可以消除L-NAME對高濃度CO2誘導氣孔關閉和NO含量升高的抑制作用。此結果表明，NOS參與了高濃度CO2促進番茄保衛細胞NO合成的過程。

2.4 NR參與高濃度CO2促進保衛細胞NO合成的過程

在植物體內，NR是組成型NO的合成路徑中另一種重要的催化酶。本試驗利用NR抑制劑鎢酸鹽研究了NR在高濃度CO2促進保衛細胞NO合成中的作用。圖5結果表明，不同濃度鎢酸鹽處理均可不同程度地恢復高濃度CO2處理的氣孔開度，當鎢酸鹽濃度為100 μmol/L時，高濃度CO2誘導的氣孔開度恢復至3.1 μm，達到最大水平。因此在之后的試驗中，鎢酸鹽濃度均采用100 μmol/L。

在高濃度CO2下，鎢酸鹽處理導致氣孔開度增加了35%，保衛細胞熒光強度降低了40%，并且添加SNP可以消除鎢酸鹽的抑制作用。在正常濃度CO2下，鎢酸鹽處理并沒有對氣孔開度和保衛細胞熒光強度產生顯著影響(圖6)。通過分析以上試驗結果，可以看出NR在高濃度CO2促進番茄保衛細胞NO的合成過程中也起著重要作用。

[注(Note): A表示CO2濃度為350 μL/ L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2濃度為800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment; L100, L200, L300, L400表示L-NAME的濃度分別為100, 200, 300, 400 μmol/L Indicate 100, 200, 300, 400 μmol/L L-NAME treatment, respectively. 柱上不同小寫字母表示不同處理間差異達到5%顯著水平Data with different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

3 討論與結論

[注(Note): A表示CO2濃度為350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2濃度為800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment;L表示L-NAME Indicate L-NAME treatment; S表示SNP Indicate SNP treatment. 柱上不同小寫字母表示不同處理間差異達到5%顯著水平 Different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

[注(Note): A表示CO2濃度為350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2濃度為800 μL/L Indicate 800μL/L CO2treatment; T50, T100, T150, T200表示鎢酸鹽的濃度分別為50, 100, 150, 200 μmol/L Indicate 50, 100, 150, 200 μmol/L tungstate treatment, respectively. 柱上不同小寫字母表示不同處理間差異達到5%顯著水平 Data with different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

二氧化碳(CO2)作為植物光合作用的主要底物,其在大氣中的濃度變化會對植物生長發育產生重大的影響。隨著大氣中CO2濃度不斷升高，越來越多的學者開始關注和研究大氣CO2濃度升高對植物的影響以及植物的響應機理。在這些研究領域中，植物氣孔對大氣CO2濃度升高的響應是一個重要方面。大量研究表明，大氣CO2濃度升高顯著影響植物的氣孔發育、下表皮氣孔密度、氣孔指數、氣孔功能和氣孔運動等方面[6, 8, 33-35]。例如，大氣CO2濃度升高可以顯著降低植物氣孔開度[6, 33, 36]。Jarvis等[33]研究指出，盡管大氣CO2濃度升高誘導氣孔關閉，但胞間CO2濃度仍略有升高有利于植物進行光合作用。另一方面，氣孔開度的縮小可以降低植物的蒸騰作用，顯著提高水分利用效率。因此，大氣CO2濃度升高可以增強植物的光合作用以及對水脅迫的耐性。本文研究發現，高濃度CO2顯著降低番茄的氣孔開度。高濃度CO2處理6 h后，與正常濃度CO2相比，氣孔開度降低了32%(圖1)。本試驗結果與許多研究者的高濃度CO2誘導擬南芥、依蘭(CedrellaOdorata.)和鴨跖草(Commelinacommunis)氣孔關閉的結論一致[32-33, 36]。

一氧化氮(NO)信號分子在植物的生長發育[10-11]、氣孔運動[12]、環境脅迫響應等生理過程中發揮重要作用[13-14]。近年來，一些學者已經關注到高濃度CO2對植物體內NO含量的影響以及NO在響應過程中的作用。Jin等[37]研究發現，缺鐵和高濃度CO2復合處理促進番茄根中NO的合成，增強了番茄對缺鐵的耐性。最近我們也發現，高濃度CO2提高了番茄根中的NO含量，從而促進番茄側根的形成和側根數量的增加[3]。大氣CO2濃度升高可以顯著增強植物的光合作用，促進蔗糖合成。Kelly等[38]研究發現，蔗糖通過己糖激酶(糖信號路徑中的一種糖磷酸化酶)誘導NO合成和氣孔關閉。本文研究發現，SNP處理導致保衛細胞中NO含量提高了119%，同時氣孔開度降低了38%(圖2)。與正常濃度CO2處理相比，高濃度CO2誘導保衛細胞中NO含量增長88%，氣孔開度降低了32%。使用NO清除劑cPTIO后，高濃度CO2誘導的NO含量增長和氣孔關閉均受到強烈抑制。研究結果表明，高濃度CO2提高了番茄保衛細胞中NO含量以及NO在高濃度CO2誘導氣孔關閉過程中起著重要作用。本研究結果也再次驗證了前人的結論，即NO信號分子誘導氣孔關閉以及NO濃度與氣孔開度大小呈負相關關系。

[注(Note): A表示CO2濃度為350 μL/L Indicate 350 μL/L CO2treatment; E表示CO2濃度為800 μL/L Indicate 800 μL/L CO2treatment. T表示鎢酸鹽Indicate tungstate treatment, S表示SNP Indicate SNP treatment. 柱上不同小寫字母表示不同處理間差異達到5%顯著水平 Different lowercases above the bars indicate significantly different at 5% level between different treatments.]

目前，已有一些學者研究高濃度CO2誘導植物氣孔關閉的調控機理，但具體的調控路徑和信號分子并不清楚。Ainsworth等[39]通過電生理學實驗發現，升高CO2濃度能夠激活K+外流通道和S型陰離子通道，刺激保衛細胞中Cl-的釋放并且提高保衛細胞中Ca2+的濃度。這些變化總體導致膜電位去極化，從而使氣孔關閉。Prior等[19]和Webb等[32]研究發現，高濃度CO2促進植物對鈣離子的吸收，提高保衛細胞中[Ca2+]i濃度。[Ca2+]i在氣孔對高濃度CO2響應中起著重要作用，降低[Ca2+]i濃度可以強烈抑制高濃度CO2誘導的氣孔關閉[36]。在擬南芥和菠菜保衛細胞中，[Ca2+]i作為NO信號轉導路徑上游或下游的信號分子誘導氣孔關閉[40-41]。此外，Bright等[16]發現，ABA促進擬南芥保衛細胞中NO的合成和誘導氣孔關閉依賴于過氧化氫(H2O2)信號路徑。ECS1(對環境CO2濃度敏感的擬南芥突變體)參與調節CO2誘導的擬南芥氣孔關閉和H2O2積累[42]。因此，在高濃度CO2誘導氣孔關閉過程中，NO、[Ca2+]i和ROS等信號分子之間的對話值得進一步研究。

在植物體內，NOS和NR是兩種主要的參與組成型NO合成的催化酶[21]。Neill等[24]報道了ABA誘導的NO濃度升高在擬南芥氣孔關閉中起著重要作用，而且NO主要是通過NOS-like途徑產生。Guo等[25]運用atnos1突變體證明了NOS對于線粒體中NO合成和ABA誘導氣孔關閉是必需的。本文研究發現，L-NAME顯著抑制高濃度CO2誘導的番茄保衛細胞中NO合成和氣孔關閉，添加SNP復合處理后可以清除該抑制作用(圖4)。研究結果表明，NOS在高濃度CO2誘導番茄NO合成和氣孔關閉過程中起著重要作用，該結論和Neill等[24]觀點一致。最近研究還發現，高濃度CO2增強番茄根中NOS的活性，從而促進了NO的合成和側根的形成[3]。另一方面，NR催化合成的NO在植物氣孔對ABA響應過程中發揮重要作用[16-17]。本文研究發現，鎢酸鹽顯著抑制高濃度CO2誘導的番茄保衛細胞中NO合成和氣孔關閉，添加SNP復合處理后可以清除該抑制作用(圖6)，表明NR參與了高濃度CO2誘導的番茄保衛細胞中NO合成。本文研究結果與Geiger等[28]的結論一致;Geiger等[28]發現高濃度CO2增強了煙草葉片內NR酶活性和NO合成。然而，Ferrario-Méry等[29]研究表明高濃度CO2降低了小麥、玉米和煙草體內NR酶活性。最近本課題組也發現，高濃度CO2對番茄根內NR酶活性沒有影響。這種差異性可能與不同的植物品種、組織部分、發育階段和生長條件等因素有關。從以上研究結果我們可以看出，NOS和NR均參與了高濃度CO2促進番茄保衛細胞NO的合成，進而誘導氣孔關閉過程。

本研究證明，高濃度CO2誘導番茄保衛細胞NO濃度升高，從而導致氣孔關閉。在該響應中，NOS和NR均參與了高濃度CO2促進保衛細胞NO的合成過程。因此筆者認為，NOS和NR催化產生的NO在高濃度CO2誘導番茄氣孔關閉中起著重要作用。該結果將為進一步理解高濃度CO2誘導植物氣孔關閉的信號轉導路徑機制提供一種新的思路。

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Nitric oxide is involved in the induced stomatal closure of tomato by high level of carbon dioxide

WANG Huan, XIAO Wen-dan, NIU Yao-fang, CHAI Ru-shan, LIU Miao, ZHANG Yong-song*

(MinistryofEducationKeyLaboratoryofEnvironmentRemediationandEcosystemHealth/CollegeofEnvironmentalandResourceScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

【Objectives】Elevated CO2has been shown to play a role in enhancing the photosynthesis of plants, and induce stomatal closure of leaf. Stomatal closure significantly decreases plant transpiration, and contributes to enhanced water use efficiency and resistance to water stress. The effect of elevated CO2on the aperture of stomata, the level of nitric oxide(NO)in guard cells and the role of NO in CO2elevation-induced stomatal closure in tomato(SolanumlycocarpumL.)were examined. In order to identify the enzymatic source of endogenous NO in guard cells, the role of nitric oxide synthase(NOS)and nitrate reductase(NR)in the CO2elevation-induced NO accumulation was investigated. 【Methods】 Tomato(SolanumlycocarpumL.)was used as experimental material. In E7/2 growth chambers, CO2treatments and/or pharmacological experiment were initiated by treating stomata at a concentration of either 350 or 800 μL/L. Then, the stomatal aperture and NO level in guard cells were measured. The levels of NO in guard cells of tomato were determined using the cell NO-specific fluorescent probe. NO levels in guard cells were measured based on the intensity of fluorescence. NOS inhibitor L-NAME and NR inhibitor tungstate were used to assess the role of NOS and NR in the CO2elevation-induced NO production, respectively. 【Results】 The present study showed that the stomatal aperture decreased to 2.3 μm after 6 hours of elevated CO2treatment, and decreased by 32% related to ambient CO2treatment. The intensity of green fluorescence showed that the level of NO in guard cells were 88% higher under elevated CO2than that under ambient CO2. CO2elevation-induced stomatal closure was reversed by treatment with NO scavenger cPTIO, the level of NO in guard cells decreased by 35% and the stomatal aperture increased to 3.2 μm, similar to those under ambient CO2. Under elevated CO2, addition of 200 μmol/L L-NAME increased the stomatal aperture by 30%, and decreased NO accumulation in guard cells by 33%; while addition of 100 μmol/L tungstate increased the stomatal aperture by 35% and NO accumulation in guard cells decreased by 40%. 【Conclusions】 Elevated CO2significantly increased the level of NO in guard cells and decreased aperture of stomata compared to ambient CO2. CO2elevation-induced stomatal closure was reversed by scavenging NO, indicating that NO plays an important role in the induced stomatal closure of tomato by CO2elevation. The pharmacological evidences showed that both NOS inhibitor L-NAME and NR inhibitor tungstate significantly decreased NO accumulation in guard cells and inhibited stomatal closure under elevated CO2, suggested that both NOS and NR were involved in CO2elevation-induced NO accumulation. Therefore, it seems to be concluded that elevated CO2promotes the production of NO through both NOS and NR, and increases the level of NO in guard cells, and induces stomatal closure in tomato.

elevated CO2; nitric oxide; nitrate reductase; nitric oxide synthase; stomata; tomato.

2014-08-01 接受日期: 2014-11-20 網絡出版日期: 2015-05-20

國家支撐計劃項目(2012BAC17B02)；浙江省團隊科技特派員項目(2012T2T209)資助。

王歡(1987—)，男，安徽宿州人，博士研究生，主要從事植物營養生理研究。E-mail: whna1999@gmail.com *通信作者E-mail: yszhang@zju.edu.cn

S641.2.601

A

1008-505X(2015)05-1243-09