乳制品中馬尿酸HPLC的測定

郭文麗，汪曉冬，廖振宇，艾玉，曹東麗

（天津市產品質量監督檢測技術研究院，天津300384）

GB2760-2011《食品添加劑使用標準》規定，乳制品中不得使用苯甲酸等防腐劑用于生鮮乳保鮮[1]。在實際檢測中，部分乳制品中能檢出苯甲酸。研究表明乳制品中的苯甲酸會天然存在，其絕大部分是生產過程中原料乳中馬尿酸脫去甘氨酸生成，并且這個反應是不可逆的[2]。馬尿酸（Hippuric Acid，HA）又名苯甲酰氨基乙酸，是食植動物代謝的副產物，多存在于馬和草食性動物的尿液中，也可通過乳汁排出，同時會存在于原料奶中[3]。因此，為了更好地研究乳制品中苯甲酸的來源，建立了能夠同時測定乳制品中馬尿酸和苯甲酸含量的HPLC 方法，該方法對控制、解決乳制品的安全衛生問題具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent1260 series；美國Agilent公司）；色譜柱（Waters 柱，150 mm×4.6 mm，粒度2.7 μm）；離心機（H2050R；長沙湘儀離心機儀器有限公司）；恒溫振蕩器（HNY-100B；天津市歐諾儀器儀表有限公司）。

1.2 主要試劑

乙腈（HPLC 級，DikmaPure 公司）；甲醇（HPLC 級，DikmaPure 公司）；苯甲酸標準品（Dr.EhrenstorferGmbH）、馬尿酸對照品；醋酸；磷酸二氫鉀；KH2PO4；氫氧化鈉；去離子水。

標準儲備液：精密稱取馬尿酸和苯甲酸標準品各5 mg，于50 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配置成濃度各為100 μg/mL 標準儲備液。

混合標準工作液：精密量取濃度為100 μg/mL 的馬尿酸和苯甲酸標準儲備液適量，用50%甲醇溶液定容，配置成濃度為0、0.1、0.2、0.5、1、5 μg/mL 的系列混合標準溶液。

1.3 高效液相色譜參數的優選[2，4-5]

本實驗采用單因素法，對HPLC 同時測定馬尿酸、苯甲酸的主要參數——流動相、柱溫、流速、進樣量等進行優選。選用1 μg/mL 的馬尿酸、苯甲酸混合標準溶液進行優選實驗。

1.3.1 流動相種類的優選

分別用下列不同的流動相對1 μg/mL 的馬尿酸、苯甲酸混合標準溶液進行測定。

（1）甲醇+0.4%醋酸溶液=35+65

（2）乙腈+0.4%醋酸溶液=35+65

（3）甲醇+0.05 mol/L 磷酸溶液=35+65

（4）乙腈+0.05 mol/L 磷酸溶液=35+65

（5）甲醇+0.02 mol/L KH2PO4溶液=35+65

（6）乙腈+0.02 mol/L KH2PO4溶液=35+65

1.3.2 流動相溶劑配比的優化

在確定流動相后，進一步優選流動相溶劑配比。分別以乙腈+0.4%醋酸溶液=15+85、25+75、35+65、45+55、55+45 為流動相，對1 μg/mL 混合標準溶液進行測定。

1.3.3 柱溫的優選

在確定流動相配比后，分別設定柱溫為25、30、35、40、45 ℃，以確定最適溫度。

1.3.4 流速的優選

設定儀器流速0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL/min，檢測混合標準溶液，根據目標物質的分離度、峰型等選擇合適的流速。

1.3.5 進樣量的優選

分別設定進樣量為5、10、15、25、50μL，測定1μg/mL的混合標準溶液。

1.4 預處理條件

樣品提取[6]。

在提取馬尿酸和苯甲酸時，要去除牛奶中的大分子干擾物質如蛋白質、脂肪等。稱取20 g 樣品（精確至0.01 g）于100 mL 容量瓶中，加入25 mL0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，混合后置于超聲波水浴或70 ℃水浴中處理15 min。冷卻后，用0.5 mol/L 硫酸溶液將pH 調節到8（用pH 計或pH 試紙均可），分別加入2 mL 92 g/L亞鐵氰化鉀溶液和183 g/L 乙酸鋅溶液。劇烈振搖，靜置15 min，混合后冷卻到室溫，再用甲醇定容，靜置15 min，4 000 r/min 離心，上清液經過0.22 μm 濾膜過濾。收集濾液作為試樣溶液，用于高效液相色譜儀測定。

2 結果與討論

2.1 檢測條件的優化

實驗結果表明，（2）流動相峰高較高、峰型相對較好、靈敏度較大；基于與雜質色譜峰的分離度、峰高、峰寬以及對稱性等因素，其35+65 的相配是最優選擇；35 ℃時，2種物質的色譜峰高而窄，對稱性好；0.6 mL/min 時，2種目標物得到了很好的分離，且分析時間短；進樣量為10 μL 時色譜峰對稱性好，峰高高。

綜上所述，本文選擇的色譜條件為：流動相組成：A 通道為去離子水，B 通道為甲醇（色譜純），C 通道為乙腈（色譜純），D 通道為0.4%醋酸溶液（已抽濾）；柱溫35 ℃；流速0.6 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長235 nm。

2.2 線性方程

對濃度為0、0.1、0.2、0.5、1、5 μg/mL 的馬尿酸、苯甲酸混合標準溶液進行檢測，測定其相應的峰面積繪制標準曲線，得線性方程、相關系數：

Y=10.250 622 5×X-0.417 895 6 R=0.999 0（馬）

Y=10.556 950 4×X+0.378 122 6 R=0.999 8（苯）

式中：Y 為面積；X 為含量。

圖1 馬尿酸、苯甲酸混合標準品譜圖（1.0 μg/mL）Fig.1 Chromatogram of mixture HA and Benzoic Acid sample（1.0 μg/mL）

在圖1中馬尿酸（HA）的出峰時間為2.841，苯甲酸（BJS）的出峰時間為4.594。

2.3 檢測靈敏度（方法測定低限）

根據國標GB/T27404-2008，方法的測定低限按下式計算：

式中：CL 為方法的測定低限；Sb 為空白值標準偏差（一般平行測定20 次得到）；b 為方法校準曲線的斜率。

在本實驗中Sb=1.113 767，b=10.250 622 5，根據上式計算方法測定低限為0.326 mg/kg（馬）；Sb=1.235 521，b=10.556 950 4，根據上式計算方法測定低限為0.351 mg/kg（苯）。

2.4 回收率實驗

取牛奶樣品，做空白對照。分別作0.5、5、10 mg/kg 3個水平、6 個平行添加回收率實驗。樣品按照前述實驗步驟操作測定。結果如下表。

表1 牛奶苯甲酸、馬尿酸的回收率Table1 Recoveries of Benzoic acid，HA in milk

2.5 精密度

分別取2 個水平，濃度為0.2、1 μg/mL 的馬尿酸、苯甲酸標準溶液在本文選取的最佳參數下做平行，進樣7 次，測定相應的峰面積。結果表明，本法的RSD（%）＜2%，具有良好的精密度，較高的重現性。且濃度較低時，相對偏差較大；濃度較大時，相對偏差較小。

表2 精密度試驗結果Table2 The result of the precision experiment

2.6 實際樣品測定

在HPLC 分析中，通過峰的保留時間將標準色譜峰與樣品色譜峰對照、定性，同時可查看相應峰的吸收波長進行精確判斷。然后利用標準曲線計算出待測樣品中2種目標物質的含量。在市場流通領域選取多家品牌不同規格的產品，樣品經前處理后進行檢測。在對13種純牛奶檢測時發現1種樣品含有馬尿酸及其轉化產物苯甲酸（見圖2）。

圖2 某純牛奶樣品檢測譜圖Fig.2 Chromatogram of milk sample

圖2為該純牛奶樣品的檢測譜圖。根據公式計算得出該樣品中馬尿酸的含量為4.6 mg/kg，苯甲酸的含量為3.4 mg/kg。

3 結論

本文建立了同時測定乳制品中馬尿酸、苯甲酸的HPLC 方法，本方法的相關系數分別為0.999 0 和0.999 8；檢出限分別為0.326 mg/kg 和0.351 mg/kg；方法的RSD（%）（n=7）＜2%，說明該方法具有良好的準確度、精密度和較高的重現性，適用于乳與乳制品中馬尿酸和苯甲酸的殘留分析。通過本實驗提供的方法可以方便、可靠地分析乳制品中苯甲酸的本底水平，有助于科學、準確的綜合判定。

[1] 中華人民共和國衛生部.GB 2760-2011 食品安全國家標準食品添加劑使用標準[S].北京:中國標準出版社,2011:352

[2] 謝國祥,吳麗莉,宋如森,等.乳制品中馬尿酸的檢測及其在發酵過程中動態變化研究[J].分析檢驗,2005(9):426-429

[3] 顧瑞霞.乳與乳制品的生理功能特性[M].北京:中國輕工業出版社,2000:213

[4] The International Dairy Federation.IDF 139 Milk,Dried Milk, Yogurt and Other Fermented Milks Determination of Benzoic and Sorbic Acid content[S].Belgium:IDF,1987

[5] 陳亞成,賈彩鳳,王疆元,等.牛乳中苯甲酸的HPLC 測定及來源分析[J].食品工業科技,2010(6):94-95,99

[6] 中華人民共和國衛生部.GB 21703—2010 食品安全國家標準乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測定[S].北京:中國標準出版社,2010:6