應用通用寡核苷酸芯片技術檢測病原菌的研究

【摘要】 本文以DNA為靶標，針對待檢細菌制備寡核苷酸芯片，根據雜交條件進行摸索，然后重新確立寡核苷酸芯片，通過結果的相似性來判斷樣本的種類。檢測中利用通用引物SUA和GO7B對涉及40多個進行擴增和標記后，針對不同的種、屬的混合模式，增加它們相互之間的分辨能力，同樣樣品中存在多個菌種時也可檢測出來，并為臨床診斷提供依據。綜合比較，該項檢測技術具有良好的使用價值。

【文獻標識碼】B

【文章編號】1674-9308（2015）06-0170-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.06.140

作者單位：152511伊春，黑龍江省雙豐林業局職工醫院

Applied Study on Oligonucleotide Microarray Technology to Detect Pathogens

ZHANG Xuefeng, Shuangfeng Forest Workers Hospital, Yichun 152511, China

[Abstract] Targeting to DNA, preparation of oligonucleotide microarray for the bacteria to be detected under hybridization conditions were found, and then re-establishment of oligonucleotide microarray, to judge by similarity of the results of sample types. Using universal primers SUA and G07B in the detection after amplification and label involved more than 40 more for different species and genus of blend modes, increase their ability to distinguish between each other, as when there are multiple strains can also be detected in a sample and provide the basis for the clinical diagnosis. The detection technology is a good value.

[Key words] Oligonucleotide microarray, Pathogen, Detection

細菌的 16SrDNA 的堿基序列在被測定的情況下，根據可變區和保守區交錯排列，通用寡核苷酸芯片技術為病原菌的快速診斷提供了技術支持，可建立平行檢測多種病原菌的微陣列技術，在其保守區和特異區設計寡核苷酸探針，運用雜交的方法對檢測系統進行分析，其結果的準確率為89.5%。通用寡核苷酸芯片技術構建的微陣列可鑒別出很多無法區分的大腸埃希菌和沙門菌，為難以分離的幽門螺桿菌鑒定提供了有效的技術手段。同時，通用寡核苷酸芯片技術實現了快速早期診斷的目的，適合臨床的實際需求。

1　寡核苷酸芯片技術檢測病原菌的重要性

由于人體體液的細菌感染往往比較兇險，尤其是神經系統的病原菌感染，如不及時治療會危及患者生命。因此，需要快速檢測標本中感染的病原菌，對細菌感染病原學診斷方法提供重要依據。過去傳統的檢測方法存在敏感度低，影響診斷結果及抗菌素的有效使用，導致很多神經疾病患者的死亡率逐年升高。利用寡核苷酸芯片可以對常見病原菌的感染標本進行檢測，該技術具有靈敏度高、不受細菌生理條件和抗生素使用的限制的優點。此外，寡核苷酸芯片技術可以根據所在地域、醫院病原菌的分布情況，同時特異檢測多種生物分子。但是點膜技術會直接影響到通用寡核苷酸芯片技術的穩定性，因此寡核苷酸芯片技術還需要在醫學實驗室繼續研究探索。目前，以通用寡核苷酸芯片檢測為代表的技術成為最有價值的研究手段，此項通用寡核苷酸芯片技術已經越來越多的應用于神經系統（CNS）感染中病原菌DNA的擴增和檢測，為細菌感染提供了快速的檢測手段，寡核苷酸芯片技術在病原微生物的檢測中有廣闊的應用前景。

2　應用通用寡核苷酸芯片技術檢測病原菌研究中存在的問題。

利用生物芯片檢測和鑒定常見病原菌技術制備寡核苷酸芯片，針對細菌的可變區設計探針，對探針進行了驗證和篩選。根據一種含26條種特異性探針的試驗芯片，對通用寡核苷酸芯片的雜交和洗滌條件進行摸索，得到新的數據，然后進行混合樣品檢測試驗及靈敏度試驗，以相對信號強度為依據的信號陰陽性判斷思路，以及以特異性寡核苷酸為檢測方式。通常情況下，通用寡核苷酸芯片技術在確立檢測模式后，從已提取的模板庫可準確地鑒定到種或屬的水平，但是由于在混合樣品很多信號模糊不清，個別菌種檢測結果需要進一步驗證，靈敏度較低，檢測系統的功能無法滿足通用寡核苷酸芯片技術。

3　利用寡核苷酸芯片技術檢測人體內的常見病原菌

3.1　檢測耐藥基因

寡核苷酸芯片技術對耐藥性檢測方法，主要受到培養法、時間、實驗結果不定因素較多的影響。該技術可同時檢測耐藥菌的多個耐藥基因，通過檢測突變位點來分析其耐藥機制，有利于在臨床上有效的使用抗生素。病原菌耐藥機制是通過水解而使抗生素失活，引起對超廣譜頭孢菌素類、單內酰環菌素類的耐藥。例如：結核病的結核分支桿菌的耐藥性，其耐藥分子機制是由于其作用靶分子RNA聚合酶的 β 亞單位的編碼基因（rpoB）突變所致 [1]。

3.2　檢測病原菌毒素

寡核苷酸芯片技術檢測病原菌毒素，主要是根據ent基因制備微陣列，建立毒力因子微陣列，可確定大腸埃希菌致病性的靶基因，為毒力基因的確定提供了強有力的技術手段。該項技術用于檢測艾滋病病毒，根據病毒逆轉錄酶產生的耐藥突變位點，將基因突變部位的全部序列構建在基因芯片上，能夠有助于快速而有針對性的進行檢測。檢測肝炎病毒（HCV）Livache的原理，是利用寡核苷酸芯片技術先確定HCV的基因型，將HCV基因探針固定于硅片上，然后將待測基因和芯片上的探針雜交，拉米夫定是抗乙肝病毒藥物，利用病毒的耐藥性突變誘導HBV產生耐藥株，達到對樣本檢測的目的。由此可見，寡核苷酸芯片是檢測HBV耐藥突變的一種可靠和有用的工具 [2]。

3.3　檢測人類乳頭狀瘤病毒

婦科檢驗中發現，低危險型別HPV常引起外生殖器濕疣，確定 HPV的型別對于探究腫瘤的病因及腫瘤的預防有重要臨床意義。通用寡核苷酸芯片技術進入了廣泛研究和應用，它具有操作簡便快速的優越性，可以對婦科中的致病菌一次得出全部檢測結果 [2]。

4　結束語

目前，寡核苷酸芯片技術可以同時檢測特異多種生物分子。但點膜技術會直接影響到該方法的穩定性，因此寡核苷酸芯片技術還需要在醫學實驗室繼續研究探索。