克唑替尼對非小細胞肺癌細胞放射增敏作用的研究

【摘要】目的 觀察體外環(huán)境下克唑替尼對NSCLC細胞的放射增敏效果及其潛在機制。方法 以H2228及H3122細胞株為實驗對象，MTT法檢測不同濃度克唑替尼對NSCLC細胞的抑制作用；平板克隆形成實驗分別測定NSCLC細胞在克唑替尼作用下照射以及單純照射的SF，擬合細胞生存曲線并計算放射增敏比；流式細胞儀檢測各細胞株的接受不同劑量放射線后細胞凋亡率及細胞周期分布的變化；Western Blot檢測各細胞株接受放射線照射后STAT3及p-STAT3蛋白表達水平變化。結(jié)果 MTT實驗：抑制率與濃度變化呈正相關(guān)。IC50分別為330 nM和102 nM。克隆形成實驗：附加藥物照射的細胞SF低于單純照射組。H2228/ H3122細胞株組中，SER（D0）：1.064/1.004；SER（Dq）：1.079/1.047。流式細胞術(shù)：兩細胞的凋亡率與照射劑量呈正比。在H2228組細胞中G0/G1期細胞阻滯現(xiàn)象明顯，H3122細胞各周期細胞比率未見明顯變化。Western Blot法：應用克唑替尼聯(lián)合時STAT3的磷酸化過程受到阻滯。H2228細胞株阻滯現(xiàn)象更為明顯。結(jié)論 克唑替尼對NSCLC H2228及H3122細胞株均有放射增敏作用，對H2228細胞株的放射增敏效果更加明顯。

【文獻標識碼】B

【文章編號】1674-9308（2015）04-0196-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.04.169

作者單位：450001鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院放射醫(yī)學教研室

The Study of Radiosensitization of Crizotinib on Cells in Non-small Cell Lung Cancer

YANG Wenkui JIAGN Wenhan LI Dianyuan, Basic Medical College of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

[Abstract] Objective To observe the radiosensitization of crizotinib on NSCLC cells in vitro and to explore the potential mechanisms. Methods NSCLC cell lines H2228 and H3122 were used in this study. MTT was used to investigate the cytotoxicity of crizotinib and define the IC50 for H2228 and H3122 cells. Clonogenic assay was used to determine cell SF of cells received radiation alone and crizotinib administrated for 36 h before irradiation, fitting cell survival curve and calculating the ratio radiosensitization. Flow cytometry was used to detect the cell lines of different doses of radiation to accept change rate of apoptosis and cell cycle distribution. Western Blotting was used to detect STAT3 and p-STAT3 protein levels of cell lines after irradiation. Results The inhibition rate was positively related with the concentration change. The IC50 concentration of crizotinib were 330 nM and 102 nM. In the H2228/ H3122 cell group, SER (D0) were: 1.064/1.004, SER (Dq) were: 1.079/1.047. H2228 cells after the application of crizotinib, G0/G1 phase cell cycle arrest phenomenon obviously. H3122 cells for application the crizotinib after each cycle the cells did not change the ratio. Conclusion The crizotinib in non-small cell lung cancer cell lines H2228 and H3122 was radiosensitizing effect, the radiosensitizing effect on the H2228 cell line was more obvious.

[Key words] Crizotinib, H2228, H3122, Apoptosis, Radiosensitizer, STAT3, P-STAT3

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，也是惡性腫瘤死亡的主要原因，其中以非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）為主，占所有類型的80%～85%，Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲa期（非N2患者）的NSCLC能夠行根治性切除術(shù) [1]。EML4-ALK融合基因的表達與非小細胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已經(jīng)成為NSCLC分子靶向治療領(lǐng)域的研究熱點 [2]。克唑替尼（Crizotinib）是口服型三磷酸腺苷競爭性抑制劑，本研究只要目的是觀察體外環(huán)境下克唑替尼對NSCLCH3122及H2228細胞株的放射增敏效果及其潛在機制。

1　材料與方法

1.1　材料

EML4-ALK融合基因陽性的H2228細胞株及H3122細胞株購自南京科佰生物科技有限公司；RPMI-1640完全培養(yǎng)液及優(yōu)級胎牛血清均購自北京索萊寶科技有限公司；克唑替尼購自Selleckchem公司；MTT購自 北京索萊寶科技有限公司；抗p-STAT兔單克隆抗體、抗STAT兔單克隆抗體及HRP-山羊抗兔IgG均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2　細胞培養(yǎng)

使用含有10%優(yōu)級胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；0.25%胰酶消化、傳代；取對數(shù)生長的細胞進行試驗。

1.3　MTT試驗

取指數(shù)生長期的細胞株消化后加入培養(yǎng)基配置成細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。將96孔板分為上下兩個區(qū)，4個重復孔。培養(yǎng)24 h加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h再加入DMSO，震蕩后放置到酶標儀中，記錄570 nm波長處的吸光度。生長抑制率（IR）＝1－（藥物作用組OD值/空白對照組OD值）×100%，計算出克唑替尼對兩細胞株的IC50值。

1.4　克隆形成實驗

采用兩細胞株的50%IC50值為后續(xù)的實驗藥物濃度。單純藥物組在加入藥物后繼續(xù)孵育72 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，當培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見細胞群落時，棄培養(yǎng)液。照射組選擇0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy的放射線下進行照射，照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細胞群落的形成。應用Sigmaplot軟件繪制劑量效應曲線，構(gòu)建多靶單擊模型，Dq = D0×1 nN 來擬合存活曲線，計算SER。

1.5　流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及細胞周期分布情況

取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期H2228與H3122細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成10 6個/ml的細胞懸液，各自分為四組進行相應的處理，以細胞凋亡試劑盒和周期試劑盒說明書收集細胞并染色后用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率和周期分布。

1.6　Western Blotting檢測STAT3及p-STAT3蛋白的表達

收集長滿瓶的H3122及H2228細胞，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，所得總蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將一抗（抗STAT兔單克隆抗體或抗p-STAT兔單克隆抗體）用TBST稀釋至適當濃度，并將封閉好的PVDF膜放入一抗稀釋液中，過夜4℃下孵育，用同樣的方法孵育二抗（HRP-山羊抗兔IgG）1 h。以β-actin作內(nèi)參照，紅外熒光Ⅱ抗顯色，分析條帶以灰度確定蛋白表達。

1.7　統(tǒng)計學方式

本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行檢驗， P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。圖像處理應用ImageJ2x及SigmaPlot10.0軟件。

2　結(jié)果

2.1　對H3122及H2228細胞株的生長抑制作用

MTT實驗結(jié)果顯示，當克唑替尼濃度分別為0～1 600 nM時，作用于H2228細胞24 h后，增殖抑制率分別是：2.89%，21.03%，34.09%，43.36%，60.75%，68.54%，84.02%，抑制率與濃度變化呈正相關(guān)，IC50濃度為330 nM。作用于H3122細胞24 h后，增殖抑制率分別是：23.17%，37.98%，49.80%，58.46%，65.62%，76.46%，84.07%，抑制率與濃度變化呈正相關(guān)，IC50濃度為102 nM。

2.2　對H3122及H2228細胞株的放射增敏作用

采用50%的IC50值為實驗藥物濃度，選用160 nM及50 nM，作用時間為36 h，根據(jù)細胞克隆集落數(shù)目計算出細胞存活分數(shù)。在等量照射劑量下，附加藥物照射的細胞存活分數(shù)低于單純照射組。經(jīng)計算兩組的SER（D0）分別為1.064/1.079、SER（Dq）分別為1.004/1.047。

2.3　流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及周期分布

H2228及H3122細胞的凋亡率與照射劑量呈正比。附加克唑替尼的細胞株經(jīng)照射后細胞凋亡率明顯高于單純照射組。在H2228組細胞中，G0/G1期比率升高；S期比率減少；G2/M期比率升高。應用了克唑替尼后G0/G1期細胞阻滯現(xiàn)象尤為突出。在H3122組細胞中，作用前后各細胞周期比率均表現(xiàn)出相同的變化趨勢。

2.4　Western Blotting檢測克唑替尼對JAK-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)信號蛋白的影響

根據(jù)克隆形成實驗及流式細胞儀得到的數(shù)據(jù)，選擇8 Gy放射劑量發(fā)現(xiàn)JAK-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路中重要的底物STAT3表達上升，及其磷酸化產(chǎn)物p-STAT3表達下降，H2228細胞株在放射線及克唑替尼的作用下，對STAT3磷酸化的阻滯作用較H3122細胞株更為明顯。

3　討論

NSCLC患者中大約有3%～5%的患者ALK基因重排，約2～5%NSCLC患者體內(nèi)形成EML4-ALK融合藍氨酸集美，高表達的EML4-ALK融合基因往往預后較差，而且對放、化療抗拒。Soda M等人首次從1例62歲的吸煙肺腺癌患者的腫瘤組織中擴增得到3926bp組成的DNA片段，翻譯轉(zhuǎn)錄得到1059個氨基酸組成的融合蛋白EML4-ALK [3]。各亞型中多見的是變體1型（EML4 13；ALK 20）占33%及變體3型（EML4 6a/b；ALK 20）占29%。EML4-ALK融合基因與EGFR突變之間是相互獨立可共存 [4]。克唑替尼是口服型三磷酸腺苷競爭性抑制劑，可抑制ALK和MET酪氨酸激酶，還能夠抑制ROS1 [5]和RON激酶的活性是目前使用較為廣泛的針對EML4-ALK融合基因的靶向治療藥物 [6]。經(jīng)細胞平板克隆法檢測后，克唑替尼對于兩細胞株均具有放射增敏作用，而對于H2228細胞株的放射增敏比更大；應用了克唑替尼及放射線后H2228細胞的G0/G1期細胞阻滯更明顯。STAT3是JAKSTAT途徑中最重要的底物，在信號轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)導過程中起到關(guān)鍵的作用，是一種雙功能蛋白，存在于細胞質(zhì)中并與酪氨酸磷酸化的信號通路相偶聯(lián) [7]。JAK-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路的異常與腫瘤的細胞凋亡、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移、增殖分化、免疫逃跑等密切相關(guān) [8]。在克唑替尼及放射線的作用下，兩細胞株均有抑制STAT3磷酸化的作用，對于H2228細胞株的阻滯效果更明顯。阻斷了以STAT3為中心的JAK-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路，進一步抑制了腫瘤細胞的血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移、增殖分化、免疫逃跑的能力，最終促進了腫瘤細胞的凋亡，腫瘤組織的縮小。