HPLC—MS/MS法測定動物組織中氯霉素的殘留

楊德敏　劉良波

摘要：為建立動物組織中氯霉素殘留的液相色譜-串聯質譜檢測方法，以氯霉素-D5為內標，乙腈和4% NaCl溶液渦旋振蕩提取動物組織中氯霉素，正己烷除去脂溶性雜質，再用水飽和乙酸乙酯液液萃取， 濃縮后HLB小柱凈化，甲醇：水（50：50）定容，HPLC-MS/MS測定。采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式，多反應監測（MRM）方式檢測，用氯霉素-D5作內標來定量。 結果表明，氯霉素檢測的線性范圍為0.5～10.0 μg/kg，r2=0.999 1，加標水平為0.2、0.4、1.0μg/kg時，平均回收率72.40%～114.20%，相對標準偏差小于11%，氯霉素的定量檢測下限為0.2μg/kg 。說明該方法基質影響小，檢測靈敏度高，檢測結果準確，回收率好，適用于動物組織中氯霉素殘留的檢測。

關鍵詞：液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）；動物組織；氯霉素；殘留

中圖分類號：R978.1+3 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）11-0014-02

氯霉素（Chloramphenicol）屬廣譜抗生素，曾在畜牧業中廣為應用，但在動物可食組織中的殘留會通過食物鏈傳給人類，長期微量攝入，不僅使人體腸道正常菌群失調[1]，而且還會抑制人體骨髓造血功能導致引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細胞缺乏癥等疾病[2]。氯霉素殘留問題已引起國際組織和世界上許多國家和地區的高度重視，歐盟、美國等均在法規中規定氯霉素殘留限量標準為“零容許量”，即不得檢出。近年來，我國出口到歐盟、美國等地區的畜禽、水產品等多次因為氯霉素超標被限制，損失達到數十億美元。我國禁止使用氯霉素，但仍存在用氯霉素治療畜禽、水產品疾病的現象。

目前國內外對氯霉素殘留的研究集中在畜禽肌肉、水產品、蝦及牛奶等的測定[3-6]，常用的檢測方法包括氣相色譜法、高效液相色譜法及氣相色譜-質譜聯用法等，現在多采用高效液相色譜-串聯質譜聯用方法（HPLC-MS/MS）。為了保障我國人民的健康及擴大動物性食品的貿易往來，有必要建立動物組織中氯霉素殘留量專屬、靈敏、定性、定量的高效液相色譜-串聯質譜聯用方法。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

畜禽肉類，取可食用肌肉組織；畜禽肝臟可取整塊；水產品類去皮后，取魚肉部分，用高速勻漿機將其均質。

1.2 儀器和試劑

儀器：液相色譜-串聯四級桿質譜儀Quattro Premier XE（美國Waters公司）；去離子水發生器；TL-18M型高速冷凍離心機；BS210S型電子天平（北京startorius公司）；OA-SYS型恒溫水浴氮吹濃縮儀；MS1/MS2型渦旋振蕩器；S180H型超聲波。

試劑：所用乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲醇均為進口色譜純；水為去離子水； 氯化鈉為分析純，4% NaCl溶液臨用前配制；水飽和乙酸乙酯用50 mL水加400 mL乙酸乙酯超聲30 min，靜置分層后取上層乙酸乙酯用。

1.3 HPLC色譜條件

Waters超高效液相色譜柱 （WATERS ACQUITY UPLC？BEH C18柱50×2.1mm，1.7μm）；流動相：甲醇：水（50：50），用前過0.20 μm濾膜，除雜脫氣；柱溫：40 ℃；流速：0.25 mL/min；進樣量：10 μL；運行時間1.5 min。

1.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：多反應監測（MRM）；電離電壓：2.8 kV；碰撞氣：氬氣3.0×10-3mbar；脫溶劑氣速：500 L/hr；錐孔氣速：20 L/hr。數據采集窗口：1.5 min；駐留時間：0.6 s。離子化模式：ESI-；質譜分辨率：單位分辨率；離子化溫度：350 ℃；離子源溫度：110 ℃。定性、定量離子及對應的錐孔電壓和碰撞電壓見表1。

1.5 標準溶液的配置

氯霉素標準溶液：精密稱量氯霉素標準品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，再用甲醇稀釋為1.0 ug/mL的標準中間液，再將其用流動相（甲醇：水=50：50）稀釋為濃度0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL的標準系列，均含內標4 ng/mL。

內標溶液：精密稱量氯霉素-D5，用甲醇超聲溶解為100 μg/mL的氯霉素-D5標準儲備液，將其用流動相稀釋為濃度40 ng/mL的使用液。

1.6 樣品處理

稱取5.00 g均質樣品于50 mL離心管中，加入100 μL氯霉素-D5內標使用液（40 ng/mL），加入5 mL乙腈和5 mL 4% NaCl溶液渦旋振蕩2 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液至另一50 mL離心管中，殘渣重復提取一次，合并上清液。加入5 mL正己烷脫脂凈化兩次，棄去正己烷層，水層用5mL水飽和乙酸乙酯提取兩次，然后合并乙酸乙酯層在50 ℃下氮吹濃縮至干，加入1 mL甲醇渦旋1 min溶解待測物，加水至20 mL超聲3 min混勻。依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis HLB（6cc 200 mg），20 mL待測物過柱，再用5 mL水洗柱子，抽干柱子后用6 mL甲醇洗脫接收，將接收液在50 ℃下氮吹濃縮至干，準確加入1.0 mL甲醇：水 （50：50），旋渦振蕩30 s后超聲2 min，過0.20μm 微孔濾膜后上HPLC-MS/MS分析。

1.7 樣品加標試驗

稱取5.00 g不同類別陰性樣品后，分別添加為氯霉素濃度0.2、0.4、1.0 μg/kg 的陽性樣品，加入100 μL氯霉素-D5內標使用液（40 ng/mL），室溫下放置20～30 min后進行樣品處理后上機分析。

2 結果與分析

2.1 線性范圍

配制濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的標準系列，均含內標4 ng/mL。以質量濃度x（ng/mL）為橫坐標，峰面積的比值y（氯霉素峰面積/氯霉素-D5峰面積）為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程為y = 0.220 312x ±0.033 617 3，r2 = 0.999 1。結果表明，氯霉素在0.5～10.0 ng/mL濃度范圍內線性關系良好。

2.2 準確度和精密度試驗

分別稱取禽類、豬肉、豬肝、水產品類陰性樣品5.00 g，每類都添加氯霉素0.2、0.4、1.0 μg/kg，每個濃度水平取6個平行樣，加入100 μL氯霉素-D5內標使用液（40 ng/mL），加標樣品的回收率為72.40%～114.20%，相對標準偏差小于11%（表2），氯霉素-D5的回收率為82.9%～102.5%。

2.3 定量檢測下限

樣品中添加濃度為0.2 μg/kg時，定量離子信噪比S/N為10.51，回收率為72.40～108.60%，相對標準偏差小于11%，因此方法定量檢測下限為0.2 μg/kg。

2.4 樣品的測定

抽取市場中畜禽產品53批，水產品60批，其中雞肉在一批樣品中檢出有氯霉素殘留樣品一批，其殘留量為0.35 μg/kg。

3 討論

3.1 提取溶液的選擇

氯霉素為中性化合物，可以用甲醇、乙腈、丙酮、和乙酸乙酯等溶劑提取，乙酸乙酯提取效率高但與水不互溶，當樣品為干粉類含水量較少的動物組織時，提取效率明顯降低。用乙腈加入4% NaCl溶液對各類干、濕動物組織樣品中的氯霉素殘留都有較高的提取效率，且加入4% NaCl溶液后能有效的降低提取物中蛋白質和油脂的含量，利于凈化。

3.2 提取方式的選擇

樣品提取時，渦旋振蕩、超聲或者振蕩提取都可以，但超聲或振蕩的時間要10 min，而渦旋振蕩只2 min。樣品批量少時可以選擇渦旋振蕩，批量多時可以選擇超聲或者振蕩，能夠大批量放入同時提取。

3.3 流動相的選擇

有報道指出在負離子模式下用乙腈代替流動相中的甲醇會增強信號強度[10]。試驗以乙腈：水（50：50）作為流動相，未觀察到靈敏度的顯著提高。而以甲醇：水（50：50）作為流動相，靈敏度已滿足要求而且出峰時間縮短，提高檢測效率。

4 結論

本方法受基質影響小，檢測靈敏度高，檢測結果準確，重現性好，適用于各類干、濕動物組織中氯霉素殘留的檢測。

參考文獻：

[1] 文 衛，鈕偉民，許偉芳.氯霉素殘留檢測技術的研究進展[J].現代預防醫學，2007，34（1）： 67-68.

[2] 王新麗.LC-MS/MS法測定魚肉中氯霉素殘留[J].中國衛生檢驗雜志，2007，17（3）：456 -457.

[3] 楊大進，蔣定國，王竹天，等.畜禽肌肉、內臟及蝦中氯霉素殘留量的檢測技術研究[J].衛生研究，2004，33（2）：198-199.

[4] 白艷玲，陳劍剛，張彩虹，等.水產品中氯霉素殘留量測定方法的研究[J].中國衛生檢驗雜志， 2005，15（6）：672-673.

[5] 孫 亮，陳海東.GC-MS/MS測定蝦仁中氯霉素的研究[J].中國衛生檢驗雜志，2003，13（3）：293.

[6] 蔣定國.高效液相色譜法測牛奶中氯霉素殘留量的研究[J].中國食品衛生雜志，2003，15（1）：36-38.