Bhas 42細胞轉化試驗高通量檢測方法的建立及應用

王穎，蒲江，齊乃松，文海若，王欣，胡燕平，宋捷，張海洲，王雪，*

（1. 中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監測中心，藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室，北京100176；2.羅氏研發中國有限公司，上海201203）

非遺傳毒性致癌物不通過作用于遺傳物質產生致癌性，即不直接作用于DNA并產生相應的遺傳損傷或突變，因此現有的遺傳毒性試驗方法無法將其檢出。建立快速、簡便、可靠的體外方法對非遺傳毒性致癌物進行檢測是當前安全性評價毒理學研究中亟待解決的問題，在藥物早期研發階段意義重大。本研究室利用導入v-Has-ras基因的Bhas 42細胞系，在成功建立了細胞轉化試驗高通量檢測方法的基礎上對Sasaki[1]建立的H2O2法進行了驗證與改進，將試驗結果量化從而實現了高通量篩選，提高了檢測效率和結果判定的客觀性。此外，我們將其應用在化學物致癌性研究中，對染料木黃酮(genistein，GEN)的潛在非遺傳毒性致癌性進行了評價。

采用Bhas 42細胞進行的兩階段細胞轉化試驗是近些年發展起來的致癌物體外早期篩查的新方法，其特點是方便、快捷、經濟。該試驗分啟動試驗和促癌試驗兩部分。啟動試驗即在細胞對數生長期給予啟動劑進行短暫處理，引起細胞基因突變而誘發轉化，檢測受試物的遺傳毒性。而促癌試驗是在細胞匯合后的生長靜止期用促癌劑處理較長的時間，阻斷細胞間通訊從而誘發轉化，檢測受試物的非遺傳毒性[2]。Bhas 42細胞是將v-Has-ras基因轉染到BALB/c 3T3細胞中建成的細胞系，被視為已處于啟動狀態，可根據細胞接種濃度、藥物作用時間點和作用時間的不同[3]，將遺傳毒性和非遺傳毒性致癌物的檢測過程完全分開。因此該方法既可用于檢測遺傳毒性致癌物，也可檢出非遺傳毒性致癌物。該方法將試驗周期縮短至3周[2，4]， 可在短期內獲得篩查結果，并對腫瘤發生發展不同階段的細胞生物學特征進行研究[5-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞Bhas 42細胞系(日本健康科學基金會健康科學研究資源庫，編號JCRB0149)由日本食品藥品安全中心秦野研究所Sasaki博士饋贈。

1.1.2 試劑和儀器3-甲基膽蒽(3-methylcholanthrene，3-MCA，100 mg)，佛波醇12-十四酸13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA， 10 mg)，GEN(25 mg)，均購自Sigma； EMEM培養基(Eagle’s minimum essential m eduim)，D MEM/F12培養基(Dulbecco’s m odified Eagle’s medium/ Ham’s F12)，胎牛血清(批號737443) 均購自Gibco；H2O2(30%)，購自國藥集團化學試劑有限公司；Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8)，購自南京凱基生物科技發展有限公司；SPECTRA max-PLUS型酶標儀，購自Molecular Devices公司。

1.1.3 試劑配制啟動試驗和促癌試驗分別以3-MCA和TPA為陽性對照，DMSO為陰性對照。3-MCA、TPA、染料木黃酮(GEN)均以DMSO為溶劑，配制成高濃度懸液儲備液，-20 ℃條件下凍存。參照文獻[4]，3-MCA和TPA使用的終濃度為1 μg/mL和50 ng/mL，用配制1000×的儲備液(3-MCA：1 mg/mL；TPA：50 μg/mL)進行稀釋。GEN儲備液的配制濃度為30 mg/mL。DMSO的終濃度為0.1%。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與凍存試驗前擴增凍存Bhas 42細胞。Bhas 42細胞用含有15%胎牛血清的EMEM培養基，在37 ℃、CO2體積分數為5%的孵箱中培養。當細胞匯合度達到70%時，用PBS清洗后用0.25%的胰酶消化細胞，將細胞密度調至5×105/mL，重懸于新鮮的含5% DMSO、15%胎牛血清的EMEM培養基中，將細胞懸液分裝于凍存管中，每管0.5 mL，并凍存于液氮中。在進行細胞轉化試驗時，為降低細胞的自發轉發率，每次進行轉化試驗都需要重新復蘇1個凍存管進行試驗。

1.2.2 高通量檢測方法[1，4]轉化試驗的結果判定采用細胞灶法和H2O2法兩種方法。兩種方法分別進行啟動試驗和促癌試驗，每個試驗設置的陽性、陰性組(H2O2法加設空白對照組)，每組1個96孔板。

細胞灶法是以接種當日為第0天，消化細胞并調整細胞密度至4×103/mL，啟動試驗和促癌試驗分別以每孔200、400個細胞的密度接種于96孔板，24 h后啟動試驗組將細胞暴露于受試物，處理3 d后更換新鮮培養基。促癌試驗組于第4天更換為含TPA的培養基，作用10 d，每3 d換一次液，第14天更換為不含受試物的新鮮培養基。連續培養至第21天，用甲醇固定10 min，5% Giemsa染色30 min，計數轉化灶個數。

H2O2法是在細胞灶法的基礎上進行改進。連續培養至第19天時每孔加入50 μL 0.0016%的H2O2，共同培養24 h。第20天加入CCK-8(終濃度為5%)染色，培養4 h后，測定450 nm下的吸光度。之后用0.25%戊二醛固定，5% Giemsa染色，計數轉化灶。

1.2.3 細胞生長試驗在進行轉化試驗前，需要進行細胞生長試驗以確定受試物對細胞的毒性作用。啟動試驗組和促癌試驗組分別以每孔200和400個細胞的密度接種于96孔板，24 h后啟動試驗組不換液，配制含二倍終濃度GEN的培養基，使GEN以30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01 μg/mL的終濃度處理細胞，第4天更換不含藥的新鮮培養基。促癌試驗組于第4天時更換為含有不同濃度GEN的培養基，同樣處理3 d。第7天采用結晶紫(crystal violet，CV)染色并于570 nm波長下測定吸光度，計算相對生長率，確定最適藥物濃度。每個濃度至少8個復孔，并設置只含有培養基的空白對照孔。相對生長率計算方法如下式：

相對生長率(%)=[D(570)處理組-D(570)空白組]/[D(570)陰性組-D(570)空白組]×100%

D(570)處理組為藥物處理孔的吸光度；D(570)空白組為空白對照孔的吸光度；D(570)陰性組為陰性對照孔的吸 光度。

1.2.4 細胞轉化試驗根據細胞生長試驗結果選定5個濃度進行細胞轉化試驗，具體操作方法同1.2.2中的H2O2法。進行轉化試驗的同時也要對選定的藥物濃度進行并行的細胞生長試驗，每個濃度至少采用一塊96孔板進行轉化檢測，且至少8個孔用于并行的細胞生長試驗，并設立陽性、陰性及空白對照組。實驗流程見圖1、2。

1.3 結果判定方法

細胞轉化灶的形態特征表現為：①多于100個細胞；②紡錘形細胞不同于接觸抑制性單層細胞(紡錘形的)；③強嗜堿性染料(嗜堿的)；④在轉化灶的邊緣(交叉)細胞隨機定位；⑤密集的多層排列的細胞(堆積)；⑥侵入性生長到周邊接觸抑制性細胞的單層內。對96孔板中含有細胞灶的孔進行計數，表示為孔/板。

1.4 統計學方法

用SPSS 19.0進行數據的統計處理。細胞灶法的結果采用卡方檢驗，H2O2法的結果采用t檢驗。GEN各濃度的轉化試驗結果采用Dunnett-t檢驗[1，4，9]，當受試物存在兩個或兩個以上濃度組的D(450)相對于陰性對照組有顯著性差異，則該受試物是陽性的。當受試物存在一個或不連續濃度組的D(450)相對于陰性對照組有顯著性差異，則該受試物是可疑的。當受試物各個濃度組的D(450)相對于陰性對照組均無顯著性差異，則該受試物是陰性的。

2 結果

2.1 高通量檢測方法的建立

經H2O2處理前，可在鏡下觀察到啟動試驗3-MCA組和促癌試驗TPA組細胞形態由正常的長梭形變為短梭狀，呈復層生長，細胞之間失去接觸抑制并形成轉化灶，轉化灶邊緣細胞隨機排列，形成交叉和旋渦。而啟動試驗DMSO組和促癌試驗DMSO組的細胞大小、形態基本一致并表現出良好的接觸性抑制，僅見少數細胞出現自發轉化，且轉化灶較小。H2O2作用24 h后，大部分正常細胞皺縮成圓形并死亡，該處理對轉化細胞無顯著影響。細胞灶法在第21天進行固定染色。啟動試驗3-MCA組和促癌試驗TPA組可見細胞發生明顯的形態變化，失去接觸抑制，形成交叉和旋渦。細胞復層生長，產生的轉化灶較明顯。而啟動試驗DMSO組和促癌試驗DMSO組只有極少數細胞出現自發轉化，且轉化效果不明顯，大部分細胞形態正常，呈長梭形(見圖3)。

計數各組轉化灶并進行統計分析。在細胞灶法中，啟動試驗3-MCA組、促癌試驗TPA組的轉化灶個數分別與啟動、促癌試驗DMSO組相比明顯升高(P＜0.01)。在H2O2法中，啟動試驗3-MCA組、促癌試驗TPA組的轉化灶個數、D(450)分別與啟動、促癌試驗DMSO組相比均明顯升高(卡方檢驗，P＜0.01)。此外H2O2法試驗組利用酶標儀進行檢測，陽性組的D(450)相對于陰性組也提示顯著性差異( t 檢驗，P＜0.01)，結果見表1。

表1 細胞灶法和H O法細胞轉化試驗結果(n=96，±s)22

表1 細胞灶法和H O法細胞轉化試驗結果(n=96，±s)22

a：卡方檢驗，與DMSO組比較，P＜0.01； b：t 檢驗，與DMSO組比較，P＜0.01.

細胞灶法H2 O2法組別受試物終濃度轉化灶(個/孔)轉化灶(個/孔)D(450)啟動試驗DMSO 0.10%13120.267±0.3243-MCA 1 μg/mL 53a 40a 0.609±0.396b促癌試驗DMSO 0.10%18150.218±0.356 TPA 50 ng/mL 40a 50a 0.704±0.550b

2.2 細胞生長試驗

選擇不同濃度的GEN處理細胞，第7天通過CV染色結果計算其相對生長率，啟動試驗和促癌試驗各組數據見表2。基于生長試驗結果設立5個濃度等級進行轉化試驗。在啟動試驗中，藥物濃度等級覆蓋范圍從最高毒性(相對于對照組的生存率小于20%)到幾乎無毒性。理想狀態下在致癌檢測中所作的評價[4]，一個濃度等級低于無作用之劑量(no-observed effect level，NOEL)，兩個濃度等級介于NOEL與IC50之間，兩個濃度等級介于IC50和IC90之間。由于在啟動試驗中，藥物濃度大于1 μg/mL幾乎沒有毒性，低于1 μg/mL時相對生長率急劇下降且低于20%，因此選擇0.03、0.1、0.3、1、3 μg/mL作為轉化試驗中啟動試驗組藥物作用濃度。在促癌試驗中，所選擇的檢測濃度范圍覆蓋從對細胞生長具有生長促進作用的濃度到對細胞生長幾乎沒有作用的濃度。由表2可看出，促癌試驗中GEN對細胞具有較弱的促生長作用，濃度為0.03、0.1、0.3、1、3 μg/mL時的相對生長率均大于50%，因此選擇其作為轉化試驗促癌試驗組藥物作用濃度。

表2 染料木黃酮(GEN)對Bhas 42細胞生長的影響(n=8)

2.3 細胞轉化試驗

于第7天測定細胞的相對生長率和第20天測得的D(450)結果見圖4。并采用Dunnett-t檢驗進行統計分析。啟動試驗GEN各濃度組D(450)相對于啟動試驗DMSO組均無明顯差異。而當促癌試驗GEN終濃度為0.03、1、3 μg/mL時相對促癌試驗DMSO組明顯升高(P＜0.01)。表明GEN無遺傳毒性，而具有非遺傳毒性。

3 討論

非遺傳毒性致癌物的相關檢測方法近年來發展迅速，如針對細胞間隙連接通訊障礙、EB病毒早期抗原(EBV-EA)的表達、基因表達譜的改變等機制或生物標志物對非遺傳毒性致癌物進行檢測。然而以上方法目前均未形成標準化方法，應用尚不廣泛。

雖然通過觀察轉化灶判定細胞轉化試驗結果的細胞灶法已經獲得廣泛認可，但因較為費時和主觀性的缺點大大限制了該方法的發展。為快速而客觀地評價轉化效率，Sasaki[1]對方法學進行了改良，采用分光光度法而非人工計數法來測定轉化效率(即H2O2法)。如Bhas 42細胞的培養皿中含有轉化灶，H2O2處理可選擇性殺死正常細胞，但對轉化灶無明顯影響。H2O2法可結合自動化儀器的使用實現高通量選擇，跳過固定、染色、洗板、曬干等一系列過程。實驗人員也不必經過鑒定轉化灶的專業培訓便可完成結果的判定。結果更為客觀，且極大地節省了實驗成本。

本研究對Sasaki建立的H2O2法進行了驗證與改進，將H2O2作用時間點從第21天改至第19天，進一步縮短試驗周期，并對H2O2濃度和CCK-8的作用時間根據實際條件進行了調整。為驗證該試驗結果的準確性，測定D(450)后對細胞進行戊二醛固定和Giemsa染色。比較D(450)可發現，含有轉化灶的孔D(450)較高，而沒有轉化灶的孔D(450)很低甚至接近空白孔，具體的選擇機制還有待深入研究。但經統計分析獲得的結果與細胞灶法結果基本一致，驗證了該方法的準確性與可靠性。

本研究室成功建立了Bhas 42細胞轉化試驗高通量檢測方法，并將其應用在非遺傳毒性致癌物研究中。植物雌激素是植物中具有弱雌激素作用的化合物，可通過與甾體雌激素受體以低親和度結合而發揮弱的雌激素樣效應，具有組織特異性，在不同組織中發揮雌激素或抗雌激素作用。GEN是大豆異黃酮的一種苷元形式，是大豆異黃酮中最有效的功能成分[10]。在結構上與哺乳動物的雌激素雌二醇相似，具有雌激素的活性基團二酚羥基，與雌激素受體的親和力比雌二醇低100倍。迄今為止，植物雌激素的抗腫瘤、預防骨質疏松、減輕更年期綜合癥等有益作用及機制逐漸被發現[11]。許多人除在飲食中攝入外，還主動攝入含有植物雌激素的保健品，GEN的安全性日益引起人們的關注。微團培養模型研究表明GEN是強致畸物[12]，且孕酮等雌激素有促進Bhas 42細胞轉化的作用[1]，是非遺傳毒性致癌物。本研究應用Bhas 42細胞轉化試驗檢測GEN的細胞轉化作用，以評價GEN的遺傳毒性和非遺傳毒性。細胞生長試驗結果表明GEN對細胞生長有一定的促進作用，但當GEN濃度高于3 μg/mL時，表現出抑制細胞生長的作用。兩次生長試驗結果基本一致，表明兩次試驗細胞的狀態基本一致，驗證了試驗的可重復性。轉化試驗結果顯示，GEN在啟動試驗中各劑量組和對照組比較，差異均無統計學意義，表明GEN無遺傳毒性。而在促癌試驗中，有3個濃度相對對照組差異顯著，且有兩個為連續濃度，表明在本實驗條件及劑量范圍內，GEN在促癌階段可促進Bhas 42細胞發生惡性轉化。因此初步認為GEN具有非遺傳毒性，屬于非遺傳毒性致癌物。目前對GEN的促癌機制尚不明確。有文獻報道[13]GEN在人體可能達到的血清濃度下，可抑制HaCaT細胞的細胞間隙連接通訊功能，提示在一定條件下可能有促癌作用。另一項研究則提示[14]GEN對N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)所誘發的NIH 3T3細胞惡性轉化有明顯的抑制作用，推測其可能是化學致癌過程的抑制劑。GEN與苯并[e]芘共同作用時細胞轉化率高中于單獨使用苯并[e]芘，但與TPA共同作用時，抑制3-MCA誘導的BALB/c-3T3細胞轉化[15]，推測GEN既可誘導細胞惡性轉化，又可抑制細胞惡性轉化，具有雙重性。

[1] Sasaki K. A method for selecting mammal transformed cells：Europe，09169631.0[P]. 2011-8-17.

[2] 王穎，王雪，李波. 兩階段細胞轉化試驗研究進展[J]. 中 國新藥雜志，2013，22(10)：1133-1136.

[3] Muramatsu D，Sasaki K，Kuroda S，et al. Comparison of sensitivity to arsenic compounds between a Bhas 42 cell transformation assay and a BALB/c 3T3 cell transformation assay[J]. Mutat Res，2009，675：66-70.

[4] Sakai A，Sasaki K，Muramatsu D，et al. A Bhas 42 cell transformation assay on 98 chemicals：The characteristics and performance for the prediction of chemical carcinogenicity[J].Mutat Res，2010，702：100-122.

[5] Yamakage K，Sui H，Ohta R，et al. Genotoxic potential and in vitro tumour-promoting potential of 2-dodecylcyclobutanone and 2-tetradecylcyclobutanone，two radiolytic products of fatty acids[J]. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen，2014，770(1)：95-104.

[6] Weisensee D，Poth A，Roemer E，et al. Cigarette smokeinduced morphological transformation of Bhas 42 cells in vitro[J].Altern Lab Anim，2013，41(2)：181-189.

[7] Ohmori K，Sato Y，Nakajima D，et al. Characteristics of the transformation frequency at the tumor promotion stage of airborne particulate and gaseous matter at ten sites in Japan[J]. Environ Sci Process Impacts，2013，15(5)：1031-1040.

[8] Benigni R，Bossa C，Tcheremenskaia O. In vitro cell transformation assays for an integrated，alternative assessment of carcinogenicity：a data-based analysis[J]. Mutagenesis，2013，28(1)：107-116.

[9] Corvi R，Aardema M，Gribaldo L，et al. ECVAM prevalidation study on in vitro cell transformation assays：General outline and conclusions of the study[J]. Mutat Res，2012，744：12-19.

[10] Kim Sh，Kim Cw，JeonSy，et al. Chemopreventive and chemotherapeutic effects of genistein，a soy isoflavone，upon cancer development and progression in preclinical animal models [J]. Lab Anim Res，2014，30(4)：143-150.

[11] Mahmoud Am，Yang W，BoslandMc. Soy isoflavones and prostate cancer：a review of molecular mechanisms [J]. J Steroid Biochem M ol Biol，2014，140(1)：116-132.

[12] 肖楊，劉然，刑麗娜，等. 采用微團培養模型探討染料木黃酮的發育毒性[J]. 癌變·畸變·突變，2010，22(4)：271-275.

[13] 嚴繼承，鄭季彥，鄭一凡，等. 幾種植物雌激素對細胞間隙連接通訊的影響[J]. 中 華預防醫學雜志，2005，2：55-57.[14] 王晨，張立實，何濤. 染 料木黃酮對NIH/3T3細胞體外短期轉化實驗的影響[J]. 中 國公共衛生，2002，16(11)：48-49.

[15] 王李偉，仲偉鑒，應賢平，等. 三 羥異黃酮對BALB/c-3T3細胞的轉化作用[J]. 癌 變·畸變·突變，2005，27(1)：48-51.