子癇前期患者胎盤中miRNA-21及Th17相關因子的表達及其關系

朱 麗，朱華英，徐玲娣，陳廷美，劉頌平

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212000；2. 江蘇大學附屬第四人民醫院/鎮江市婦幼保健院，江蘇 鎮江 212000)

論 著

子癇前期患者胎盤中miRNA-21及Th17相關因子的表達及其關系

朱 麗1，朱華英2，徐玲娣2，陳廷美2，劉頌平2

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212000；2. 江蘇大學附屬第四人民醫院/鎮江市婦幼保健院，江蘇 鎮江 212000)

目的探討胎盤中Th17細胞相關因子IL-17、IL-21、RORc、人類白細胞抗原-G(HLA-G)蛋白及胎盤中微小RNA(micro-ribonucleic acid,miRNA)-21在子癇前期發病中的作用。方法選擇孕33～37周行剖宮產分娩的子癇前期產婦20例作為子癇前期組，選擇孕38周以上自愿要求行剖宮產產婦20例作為正常對照組。采用實時熒光定量-聚合酶鏈反應技術檢測胎盤組織中IL-17、IL-21、RORc 、HLA-G蛋白以及miRNA-21的表達量。結果子癇前期組胎盤中IL-17、IL-21及miRNA-21相對表達量均明顯高于正常對照組(P均<0.01)，RORc和HLA-G相對表達量明顯低于對照組(P均<0.05)。2組胎盤組織中IL-17、IL-21及miRNA-21表達均呈正相關,RORc和HLA-G表達均呈負相關。結論子癇前期患者胎盤組織中miRNA-21表達升高，促使Th17細胞激活，導致IL-17和IL-21分泌增加；同時miRNA-21表達升高，使得RORc mRNA和HLA-G mRNA的穩定性降低，產生基因沉默影響轉錄，導致RORc和HLA-G表達減少。IL-17、IL-21、RORc 、HLA-G蛋白以及miRNA-21可能與子癇前期發病有關。

子癇前期；miRNA-21；Th17細胞相關因子

懷孕前血壓正常的孕婦在妊娠20周以后出現高血壓、蛋白尿稱為子癇前期或前兆子癇(preeclampsia,PE)，其是妊娠期孕婦的并發癥之一，有2%～7%首次受孕的健康孕婦深受其害[1]。子癇前期常伴隨早產、胎兒生長受限、圍生期胎兒死亡以及子女成年后長期健康問題等[2]，并會增加孕產婦和嬰兒在未來患心血管疾病以及2型糖尿病(T2DM)的危險[3]。目前子癇前期的致病機制尚未闡明[4]。隨著對表觀遺傳調控機制研究的深入，逐漸發現表觀遺傳調控在多種復雜疾病的發生發展中起重要作用，其中微小RNA(micro-ribonucleic acid,miRNA)是近年來發現的最重要的表觀遺傳調控現象之一[5]。本研究探討了子癇前期患者胎盤中miRNA-21及Th17相關因子IL-17、IL-21、RORc、HLA-G的表達情況及其相關性，旨在為子癇前期針對性治療提供新的想法和依據。

1 臨床資料

1.1研究對象 選擇2012年3月—2014年5月在鎮江市婦幼保健院行剖宮產分娩的孕33～38周子癇前期孕婦20例作為子癇前期組，年齡25～29(28.5±2.2)歲。孕前子癇前期診斷參照《婦產科學》[6]標準：BP≥160/110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；尿蛋白≥2.0 g/24 h或定性試驗≥()；血清肌酐>106 μmol/L，除非以前就已有升高；血小板<100×109L-1；毛細血管病性溶血(LDH升高)；ALT或AST升高；持續性頭痛或其他大腦或視覺障礙；持續性上腹痛。選擇孕38周以上自愿要求行剖宮產正常產婦20例作為正常對照組，年齡25～28(27.9±3.0)歲。2組產婦均無高血壓、心臟病、腎病、糖尿病、血小板減少等病史，無近期感染證據，未經生殖技術幫助，無免疫性疾病，未經免疫藥物治療，2組產婦年齡比較差異無統計學意義。

1.2標本的采集 待胎盤娩出后，于胎盤正中母體面避開鈣化灶取1 cm×1 cm×1 cm大小的全層胎盤組織1塊，經無菌生理鹽水反復漂洗后置入無RNA酶的EP管中，保存于-80 ℃冰箱待PCR成批檢測。

1.3檢測方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)技術檢測2組胎盤組織中miRNA-21的相對表達量: ①Tiangen Biotech提取胎盤組織總RNA，按說明書操作。②逆轉錄合成cDNA，于-20 ℃保存。③PCR擴增：試劑盒(FP401)購自日本Toyobo公司，采用U6 RNA(一種小核RNA，參與前體RNA剪接體的構成)作為內參照。所用引物由試劑公司設計合成。熒光定量PCR條件設置：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，進行35個循環。采用PCR技術檢測2組絨毛和蛻膜中目的基因IL-17、IL-21、RORc及HLA-G表達量：①Tiangen Biotech提取細胞總RNA,按說明書操作。②逆轉錄合成cDNA，于-20 ℃保存。③PCR擴增：采用ABI 7500 PCR 系統及SYBRgreen I染料法進行熒光定量PCR檢測，采用β-actin作為內參照。所用引物由試劑公司設計合成，PCR條件設置:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,61 ℃ 1 min,共35個循環。

2 結 果

2.1胎盤組織中miRNA-21表達情況 子癇前期組胎盤中miRNA-21相對表達量為0.155±0.01，正常對照組為0.087±0.01，2組比較差異有統計學意義(t=4.360,P<0.01)。見圖1。

圖1 2組胎盤組織中miRNA-21相對表達量散點圖

2.2胎盤組織中IL-17、IL-21、RORc以及HLA-G表達情況 子癇前期組胎盤組織中IL-17和IL-21相對表達量均明顯高于對照組(P均<0.01)，RORc和HLA-G相對表達量均明顯低于對照組(P均<0.05)，見表1，2組各指標相對表達量散點圖見圖2～5。

表1 2組產婦胎盤組織中IL-17、IL-21、RORc以及HLA-G表達情況

圖2 2組胎盤組織中IL-17相對表達量散點圖

圖3 2組胎盤組織中IL-21相對表達量散點圖

圖4 2組胎盤組織中RORc相對表達量散點圖

圖5 2組胎盤組織中HLA-G相對表達量散點圖

2.3miRNA-21、IL-17、IL-21、RORc及HLA-G表達的關系 2組產婦胎盤組織中IL-17、IL-21及miRNA-21表達均呈正相關(r=0.490 6，0.471 3，0.413 6，P<0.05),2組RORc和HLA-G表達均呈負相關(r=-0.380 9，-0.409 3，P<0.05)。

3 討 論

子癇前期是正常孕婦在妊娠20周后出現，并伴隨血管內皮發生功能障礙和血管痙攣的一類免疫系統疾病。子癇前期在發展中國家的發病率高達4%～18%，同時它也成為發展中國家造成死產以及早產兒死亡的第二大元兇[7]。目前已有文獻報道Th17細胞參與了子癇前期的發生發展過程[8]，也有文獻提及miRNA家族可能促進子癇前期的發病[9]，但這三者之間的聯系以及子癇前期發病的確切機制尚未完全闡明。故本研究通過對miRNA-21以及Th17相關因子相對表達量的檢測來探索三者間的關系。

miRNA家族是一類長約22個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3’端非翻譯去相互作用，從而調控靶基因的表達，進而廣泛地作用于生長發育、衰老凋亡、腫瘤發生、免疫應答等各種生物學過程[10]。本研究發現子癇前期組孕產婦的胎盤血中miRNA-21的相對表達量遠遠高于正常對照組，提示miRNA-21與子癇前期的發病成正相關關系，說明miRNA-21在子癇前期的發生發展中起到關鍵性的調控作用。

最近有研究表明，Th17細胞可以介導炎癥反應、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等的發生發展，其可以通過產生IL-17、IL-6、IL-21和其他炎癥遞質來調節促炎反應過程[11]。另有報道稱，除了Th1/Th2之間的平衡，Th17，Treg細胞之間的比例失衡也會導致子癇的發生[12]。本研究結果顯示子癇前期組產婦的胎盤組織中IL-17和IL-21的相對表達量明顯高于正常對照組，提示子癇前期產婦體內Th17細胞曾被激活，導致Th17，Treg細胞之間的比例失衡，IL-17和IL-21釋放增加。

RORc1或RORc2屬于RTK家族，是被廣泛研究的非典型Wnt受體成員，和人類幾種疾病息息相關。研究發現在小鼠體內RORc1或RORc2的缺失是致命的，將會導致骨骼、肺臟和心臟的發育缺陷[9]。HLA-G首次在母胎界面的滋養層細胞中被發現，在病毒性感染和幾種自身免疫性疾病中也會特異性表達。有研究表明，HLA-G可以通過激活細胞毒性淋巴細胞從而防止角化細胞的破壞[13]；而且其在胎盤滋養層細胞中高度表達，在孕期調節免疫耐受和繼續妊娠方面發揮著重要的作用[8]。本研究發現子癇前期組產婦胎盤組織中RORc和HLA-G的相對表達量都低于正常對照組，表明子癇前期產婦體內調控RORc和HLA-G的基因的穩定性降低，產生基因沉默影響轉錄，導致RORc和HLA-G表達減少，從而導致了一系列子癇前期患者現有的表現如早產、胎兒生長受限、圍生期胎兒死亡等。

綜上所述，子癇前期的發病可能是激活了miRNA-21的過表達，促使Th17細胞激活，從而導致IL17和IL21分泌增加，引起全身免疫性炎癥反應。同時可能由于miRNA-21在子癇前期患者胎盤組織中表達升高,從而使得RORc mRNA和HLA-G mRNA的穩定性降低，產生基因沉默影響轉錄，導致RORc和HLA-G表達減少，有待試驗研究進一步證實。目前人們對于子癇前期的研究還處于起步階段，深入研究子癇前期的生理、病理變化以及其發病機制，對日后子癇前期的早發現、早診斷、早治療具有重大的理論和實際意義。

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Expression of miRNA-21 and correlation factors associated with Th17 cells and analysis their relations in placenta of patients with preeclampsia

ZHU Li1, ZHU Huaying2, XU Lingdi2, CHEN Tingmei2, LIU Songping2

(1.Medical College of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu, China; 2.The Fourth People’s Hospital of Jiangsu University/Zhenjiang Maternal and Child Care Hospital, Zhenjiang 212000, Jiangsu, China)

Objective It is to study the predictive value of IL-17, IL-21, RORc, HLA-G associated with Th17 cells and micro-ribonucleic acid-21(miRNA-21) in placenta on the pathogenesis of preeclampsia. Methods 20 pregnant women with preeclampsia with 33-37weeks’ gestation undergoing cesarean section were selected as preeclampsia group, 20 healthy pregnant women with more than 38 weeks’ gestation volunteered for cesarean section as normal control group. Expression of IL-17,IL-21,RORc ,HLA-G and miRNA-21 in placenta were measured by Polymerase Chain Reaction (PCR). Results The relative expressions of IL-17 and IL-21 in placenta were higher, while that of RORc and HLA-G were lower in preeclampsia group than those in normal control group (P<0.01 or <0.05).The relative expressions of IL-17, IL-21 and miRNA-21 in placenta in both groups were positively correlated,.the relative expressions of RORc and HLA-G in placenta were negatively correlated. Conclusion We found that the relative expressions of miRNA-21in placenta was more higher in preeclampsia group.Higher expression of miRNA-21 may make Th17 cells activated, then increased IL-17 and IL-21 secretion. At the same time ,higher expression of miRNA-21 may influence the RORc mRNA and HLA-G mRNA stability, then reduced the expression of RORc and HLA-G.

preeclampsia; miRNA-21; correlation factors associated with Th17 cells

朱麗，女，在讀研究生，研究方向為影像醫學與核醫學。

朱華英，E-mail:zhuhuaying1@163.com

江蘇省衛生廳重大項目(H201249)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.29.001

R0714.245

A

1008-8849(2015)29-3193-04

2015-05-10