布比卡因增強小鼠成肌細胞溶酶體的活性

熊靜薇 毛雨 李榮榮 丁正年

布比卡因是臨床上常用的局部麻醉藥(local anesthetics，LA)，其鎮痛效果顯著且持續時間長，因而廣泛應用于手術中區域麻醉和手術后疼痛管理。研究證實，臨床上使用的局部麻醉藥均存在骨骼肌毒性，過量使用會引起注射部位的肌肉組織缺血壞死，肌纖維斷裂。其中，布比卡因的肌毒性最大［1］。

溶酶體是一組含有多種水解酶，并起消化作用的細胞器，專司降解各種外源性和內源性的大分子物質。在外傷、炎癥、缺血等病理狀態下，細胞異噬和自噬活動增強，溶酶體數目增加，以適應細胞的吞噬功能，如中性粒細胞和巨噬細胞［2］。但是溶酶體是否參與布比卡因所致的肌肉損傷，目前尚不清楚。為探討該問題，我們采用小鼠成肌細胞C2C12體外培養模型，分析布比卡因對C2C12細胞溶酶體數量與活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠成肌細胞C2C12來自美國模式菌種收集中心(ATCC)。布比卡因、氯喹和α-Tubulin抗體購自美國SigmaAldrich公司。DMEM細胞培養基，胎牛血清(FCS)，LysoSensor Yellow/Blue DND-160和LysoTracker Red DND-99均購自美國Invitrogen Life技術公司。胰蛋白酶250為北京經科試劑公司產品。MagicRed Cathepsin assay kit試劑盒購自美國Immuno-Chemistry公司。溶酶體相關膜蛋-1(LAMP-1)抗體購自美國Cell Signaling技術公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與實驗分組:用含10%FCS的DMEM培養基培養C2C12細胞，達到80%單層融合時傳代并分為2組。對照組:細胞培養液中不加任何藥物;布比卡因組:細胞培養液中加入600 μmol/L布比卡因刺激細胞6 h。

1.2.2 溶酶體腔pH評價:LysoSensor Yellow/Blue DND-160在酸性環境中表現出pH依賴的熒光強度增加［3-4］。用24孔板培養C2C12細胞，布比卡因(600 μmol/L)或者氯喹(10 μmol/L)刺激細胞6 h后，加入LysoSensor試劑(5 μmol/L)孵育1 h。于激光共聚焦顯微鏡下檢測熒光強度，激發/發射波長為329/440～450 nm，并拍攝圖片。

1.2.3 示蹤溶酶體:布比卡因刺激C2C12細胞6 h后，加入LysoTracker Red DND-99試劑(75 nmol/L)孵育30 min［5-8］。于激光共聚焦顯微鏡下檢測激光強度，激發/發射波長為577/590 nm，并拍攝圖片。

1.2.4 蛋白質免疫印跡法檢測LAMP-1和Cathepsin B水平:布比卡因刺激C2C12細胞6 h后收集細胞，提取胞漿蛋白，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質，轉膜，牛奶封閉，一抗4℃過夜。徹底洗滌后，加入HRP標記的二抗4℃孵育2 h。顯影劑顯色后，暗室曝光在X光膠片上。LAMP-1和Cathepsin B表達量以LAMP-1和Cathepsin B與α-Tubulin比值表示。每組實驗重復3次。

1.2.5 Cathepsin B活性分析:布比卡因刺激C2C12細胞6 h后，加入MagicRed染料避光孵育45 min。用熒光計測量熒光強度，激發/發射波長為590/645 nm。于熒光顯微鏡下拍攝圖片。

1.3 統計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量數據均用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 布比卡因不影響C2C12細胞溶酶體腔pHLysoSensor Yellow/Blue DND-160是一種有熒光標記的向酸性染料，由于質子化作用聚集于酸性細胞器，其熒光強度隨溶酶體腔pH的變化而改變。溶酶體腔正常呈酸性(pH為3.5～5.5)。氯喹具有堿化溶酶體的作用，因此常被用作溶酶體堿化的工具藥物。本實驗中，氯喹處理的細胞作為溶酶體堿化陽性對照。如圖1所示，與對照組相比，布比卡因組溶酶體熒光強度無變化，氯喹組熒光幾乎猝滅。本結果提示布比卡因不影響C2C12細胞的溶酶體腔pH。

圖1 布比卡因對溶酶體pH的影響(n=3)

2.2 布比卡因增加C2C12細胞溶酶體含量Lyso-Tracker Red DND-99是一種熒光標記的親脂性染料，具有高度選擇性，能夠透過細胞膜而積聚于活細胞溶酶體。用LysoTracker標示溶酶體，檢測溶酶體含量，以平均熒光強度為單位，布比卡因組為44092±750.88，對照組為38289.75±585.01，布比卡因組的熒光單位增加15.15%(P＜0.01)，見圖2。本結果提示布比卡因增加C2C12細胞溶酶體含量。

圖2 布比卡因溶酶體含量的影響(n=4)

2.3 布比卡因增加C2C12細胞LAMP-1表達LAMP-1特異性的表達于溶酶體膜上，是溶酶體再生過程中必不可少的組成部分。以相對灰度為單位，布比卡因組蛋白表達量為1.36±0.02，對照組為1.0±0.07，布比卡因組LAMP-1蛋白表達量增加36.41%(P＜0.01)，見圖3。本結果提示布比卡因增加C2C12細胞LAMP-1表達量。

圖3 布比卡因對LAMP-1蛋白表達量的影響

2.4 布比卡因增強C2C12細胞溶酶體活性溶酶體活性與溶酶體蛋白水解酶Cathepsin B活性成正相關。以相對灰度為單位，布比卡因組Cathepsin B蛋白表達量為1.35±0.21，對照組為1.0±0.15，布比卡因組Cathepsin B蛋白表達量增加35.29%(P＜0.01)，見圖4。用MagicRed染色檢測Cathepsin B活性，如圖5所示，與對照組相比，布比卡因組熒光強度增加23.74%(P＜0.01)。本結果提示布比卡因增強C2C12細胞的溶酶體活性。

圖4 布比卡因對Cathepsin B蛋白表達量的影響

3 討論

局部麻醉藥是臨床實施局部麻醉和鎮痛所必需的藥物。靜脈泵鎮痛，硬膜外置管鎮痛及周圍神經阻滯都需要局部麻醉藥參與［9-10］。關于局部麻藥所致肌毒性的分子機制的討論有很多。其中，局部麻藥引起的細胞內鈣離子濃度增加被認為是引起急性細胞毒性的主要因素。局部麻藥誘導鈣離子從肌漿網釋放，同時抑制肌漿網對鈣的重吸收，破壞細胞內鈣離子的穩態［11］。抑制線粒體功能會加重局麻藥肌毒性［12-13］，誘導凋亡也與局部麻藥肌毒性有關［14］。

溶酶體是一組含有多種水解酶，并起消化作用的細胞器，在蛋白質降解中具有重要的作用。病理條件下，嚴重的細胞損傷會破壞溶酶體膜的滲透性，引起溶酶體酶釋放，細胞水解，最終導致細胞死亡。在布比卡因介導的肌毒性中，溶酶體是否被激活是本研究關注的重點。

圖5 布比卡因對Cathepsin B活性的影響(×400，n=3)

溶酶體pH與細胞的消化降解能力密切相關。溶酶體腔正常pH為3.5～5.5，這種酸性環境被認為最有利于水解酶發揮作用。LAMP-1是位于溶酶體膜上的一類特異的蛋白質。溶酶體水解酶是溶酶體蛋白降解系統中一組參與細胞代謝、肽鏈合成及蛋白降解的蛋白水解酶［15］。溶酶體水解酶分為2大類，前者包括半胱氨酸蛋白酶類如Cathepsin B、L、S，后者包括天冬氨酸蛋白酶類如Cathepsin D、E。溶酶體水解酶同時參與機體的免疫、溶骨、細胞凋亡和中樞神經系統的成熟及發育等生理作用［16］。此外，它們還參與很多病理過程，例如在人體腫瘤中發現Cathepsin B上調［16］。

本研究結果提示，在小鼠成肌細胞C2C12體外培養模型中，布比卡因不改變溶酶體腔pH，但布比卡因組LAMP-1與Cathepsin B表達量均較對照組顯著升高。由此表明，布比卡因不影響溶酶體腔pH，但是能增加溶酶體含量、增強溶酶體活性。

本研究初步發現布比卡因所致肌毒性與溶酶體的關系，但具體機制尚不明確。下一步研究工作將重點闡明自噬溶酶體途徑在局部麻醉藥肌毒性中的作用。

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