硫化砷誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡研究

王娟 姚瑤 陳麗娟

砷劑雖然是一種毒性藥物，但作為傳統(tǒng)中藥成分用于治療疾病亦歷史悠久。于20世紀(jì)70年代，我國哈爾濱學(xué)者利用含砒霜即三氧化二砷(AS2O3)的民間驗方“癌靈1號”治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)取得良好療效［1］，使砷劑這一古老的中藥煥發(fā)了新的光彩，目前已用于多種腫瘤的治療。多發(fā)性骨髓瘤(MM)是惡性漿細(xì)胞增殖性疾病，是不可治愈的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，本文觀察了硫化砷(As4S4)對MM細(xì)胞株U266細(xì)胞凋亡效應(yīng)，并對其機(jī)制作了初步探討。

1 資料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞接種于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco BRL公司)中，飽和濕度條件下，37℃、5%CO2中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2 細(xì)胞增殖活性測定采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法［2］。U266細(xì)胞以1×108/L接種于96孔培養(yǎng)板中，在終濃度為1、2、3、4 μmol/L As4S4作用下培養(yǎng)48 h，離培養(yǎng)終點4 h加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO，酶標(biāo)儀于570 nm處測吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。細(xì)胞活率由臺盼藍(lán)拒染法檢測，根據(jù)處理組存活細(xì)胞數(shù)與死細(xì)胞數(shù)的比例來計算。用細(xì)胞離心涂片器(Shandon，Runcorn，UK)收集細(xì)胞至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。生長抑制率及細(xì)胞活率按如下公式計算:生長抑制率=(對照組細(xì)胞數(shù)-處理組細(xì)胞數(shù))/對照組細(xì)胞數(shù);細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))。

1.3 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、annexin-V、線粒體跨膜電位(Δψm)和氧自由基(ROS)

1.3.1 細(xì)胞周期分析:參照文獻(xiàn)［3］，收集(1～2)×106細(xì)胞用70%的冷乙醇在-20℃固定過夜，經(jīng)PBS(phosphate-buffered saline)緩沖液充分漂洗后，用含1%核糖核酸酶(RNase)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液(pH 7.4)37℃處理30 min，并用250 μg/ml碘化丙啶染色。DNA含量分布由流式細(xì)胞儀檢測。所有數(shù)據(jù)由Beckman Coulter公司的Multicycle軟件收集、存儲和分析。

1.3.2 Annexin-V分析:使用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Annexin V和碘化丙啶(PI)雙染法檢測細(xì)胞凋亡，根據(jù)BD Biosciences公司提供的說明書操作。取(1～2)×105細(xì)胞，經(jīng)PBS漂洗后加100 μl結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞，加5 μl AnnexinV-FITC，10 μl PI避光孵育15 min后加400 μl結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.3 線粒體跨膜電位檢測:參照文獻(xiàn)［4］，取5×105細(xì)胞，PBS清洗1次，加入10 μg/ml Rh123 37℃孵育30 min，PBS漂洗1次，加入終濃度10 μg/ml PI 4℃暗處放置30 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.4 活性氧的測定方法:細(xì)胞內(nèi)活性氧測定方法參照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行，二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFHDA)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比。將藥物處理的細(xì)胞(1×105)經(jīng)過磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，重懸于1 ml含有10 μmol/L DCFHDA(sigma，USA)的PBS中，以未加染料的樣品作為對照，37℃孵育20 min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測5000個活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 As4S4對U266細(xì)胞增殖抑制和殺傷作用我們觀察了As4S4對MM細(xì)胞U266的影響，發(fā)現(xiàn)As4S4呈時間和劑量依賴的方式抑制U266細(xì)胞的生長，同時伴有細(xì)胞活率的降低。經(jīng)48 h處理后生長抑制率在1、2、3、4 μmol/L濃度時分別為32.8%、39.8%、57.8%和64.6%;活率在0、1、2、4 μmol/L時分別為95.9%、87.7%、72.6%和42.6%，見圖1。因此選擇As4S4 4 μmol/L作為藥物處理濃度。

圖1 As4S4對U266細(xì)胞增殖抑制和殺傷作用

2.2 As4S4誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡4 μmol/L As4S4處理U266細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變:染色體凝聚、細(xì)胞核破裂而細(xì)胞膜保持完整等凋亡特征，見圖2A。annexin V-FITC/PI雙標(biāo)結(jié)果顯示，48 h時凋亡細(xì)胞占48.5%，見圖2B。線粒體跨膜電位檢測顯示線粒體跨膜電位輕度降低，見圖2C。

2.3 As4S4處理U266細(xì)胞DNA含量分布U266細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L As4S4處理后DNA含量檢測顯示細(xì)胞周期阻滯在G1期，G1期由53.4%增加到83.7%;而S期明顯降低，由35.3%降低至3.4%，結(jié)果見圖2D。

2.4 As4S4增加U266細(xì)胞活性氧濃度我們采用DCFHDA檢測As4S4處理U266細(xì)胞活性氧，發(fā)現(xiàn)As4S4作用于U266細(xì)胞12 h時活性氧水平增高，而24 h時活性氧恢復(fù)到正常水平。結(jié)果見圖3。

3 討論

MM在歐美國家的年發(fā)生率是(2～5)/10萬人口，在我國為1/10萬人口。幾十年來一直采用激素和細(xì)胞毒性藥物聯(lián)合化療，盡管近年來加用反應(yīng)停抑制血管新生治療或采用自體骨髓移植治療，但仍是一種不能治愈的血液系統(tǒng)腫瘤。砷劑用于治療惡性腫瘤歷史悠久，研究顯示AS2O3具有抑制MM細(xì)胞生長和誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡作用［6］。As4S4亦是傳統(tǒng)中藥的主要成分，As4S4治療白血病臨床效果顯著，不良反應(yīng)較小，As4S4與氧化砷雖同為砷劑，但在分子結(jié)構(gòu)、砷的價態(tài)、給藥途徑、作用特點等方面存在很大差異，作用機(jī)制亦不同。As4S4對于MM的作用尚屬未知，對其進(jìn)行深入研究很有必要。

圖2 4 μmol/L As4S4誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡作用

圖3 4 μmol/L As4S4誘導(dǎo)U266細(xì)胞ROS產(chǎn)生DCFHDA流式細(xì)胞儀檢測其熒光強(qiáng)度

我們的研究結(jié)果顯示As4S4對MM細(xì)胞株U266細(xì)胞具有生長抑制效應(yīng)，此作用呈現(xiàn)時間和劑量依賴性，在抑制生長的同時伴有細(xì)胞活率的降低，同時細(xì)胞形態(tài)學(xué)上伴有凋亡特征。DNA含量的分析顯示As4S4能誘導(dǎo)U266細(xì)胞周期靜止，大部分細(xì)胞被阻滯在G1期，從側(cè)面證實了其增殖抑制效應(yīng)。部分化療藥物可使處于周期靜止期的細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段。我們用檢測細(xì)胞早期凋亡最敏感的指標(biāo)Annexin V檢測了其誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡活性，結(jié)果表明As4S4具有誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡效應(yīng)。細(xì)胞凋亡存在外源性和內(nèi)源性2種途徑，在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號通路中發(fā)生凋亡的細(xì)胞線粒體跨膜電位會降低，我們用Rh123檢測了As4S4處理U266細(xì)胞時線粒體跨膜電位改變，發(fā)現(xiàn)線粒體跨膜電位輕度降低，說明其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用部分通過內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑，即線粒體信號通路發(fā)揮作用。

許多化療藥物是通過影響細(xì)胞內(nèi)自由基水平才實現(xiàn)其抗腫瘤作用的。常用化療藥阿霉素、絲裂霉素、放線菌素代謝時產(chǎn)生半醌自由基，它能促進(jìn)核膜與線粒體膜的脂類氧化［7］。近年的研究認(rèn)為活性氧是細(xì)胞凋亡的信號之一［8］，Yi等［9］報道As2O3通過誘導(dǎo)NB4細(xì)胞線粒體產(chǎn)生活性氧類(ROS)而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)同樣會導(dǎo)致ROS的生成，線粒體對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力(ER stress)誘導(dǎo)的ROS累積和凋亡的發(fā)生亦具有重要意義，ROS在ER stress誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［10］。我們檢測結(jié)果顯示12 h時熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，24 h熒光強(qiáng)度恢復(fù)正常，說明As4S4在作用早期可增加U266細(xì)胞ROS濃度，從而啟動細(xì)胞凋亡。ROS的產(chǎn)生不僅可通過線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，亦可經(jīng)ER stress通路誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡。

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