鄰苯二甲酸酯類化合物在引起尿道下裂過程中對Leydig細胞的影響

蔣旭平，沈百欣(綜述)，張　煒(審校)

(1.南京醫科大學第一附屬醫院泌尿外科，南京 210029； 2.南京醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，南京 210011)

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分子生物醫學

鄰苯二甲酸酯類化合物在引起尿道下裂過程中對Leydig細胞的影響

蔣旭平1△，沈百欣2(綜述)，張煒1※(審校)

(1.南京醫科大學第一附屬醫院泌尿外科，南京 210029； 2.南京醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，南京 210011)

摘要：近年來，新生兒尿道下裂的發病率呈逐年上升的趨勢，越來越受到專家和學者的重視。鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)被認為是新生兒尿道下裂的作用因素之一，其在環境中的廣泛存在對人類的健康產生嚴重影響，尤其在雄性生殖系統方面。多項研究表明，Leydig細胞是PAEs的靶細胞之一，但PAEs對Leydig細胞的作用機制尚不明確。該文闡述PAEs對Leydig細胞影響的最新發現，并討論PAEs在導致尿道下裂過程中，對Leydig細胞作用機制的最新進展，為后續的研究和探索提供新的思路。

關鍵詞：鄰苯二甲酸酯類化合物；尿道下裂；Leydig細胞

尿道下裂是男性兒童泌尿生殖系最常見的先天畸形之一，發病率為出生男嬰的1/300～1/250[1]，并且在世界范圍內呈逐漸增加的趨勢[2-4]。鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalate acid esters，PAEs)是尿道下裂的重要發病因素之一，是一類脂溶性有機化合物，作為塑化劑被廣泛應用[5]。PAEs包括鄰苯二甲酸-2-乙基己基酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)等幾十種，廣泛存在于空氣、土壤和水源中，可通過呼吸道、皮膚、消化道以及輸血、腎透析等途徑進入人體，對雄性生殖系統產生顯著影響。近幾年，PAEs導致尿道下裂的機制被廣泛的研究，Leydig細胞是PAEs的重要靶細胞，現就PAEs對Leydig細胞的影響及其作用機制予以綜述。

1尿道下裂的形成及其影響因素

在胚胎發育期，尿道溝在腹側從后向前閉合，形成正常男性尿道，如發育障礙、尿道溝未完全閉合，就形成尿道下裂。尿道下裂常合并發生隱睪、睪丸癌和精子發生異常，這些疾病被統稱為睪丸發育不全綜合征，是男性胎兒在胚胎和性腺發育時受到干擾，而形成生殖系統的一系列異常。尿道下裂的發病機制至今尚不明確，可能涉及遺傳因素[6]、內分泌因素[7]、環境因素[8]和其他因素。目前研究多集中在具有擬雌激素或抗雄激素作用的內分泌干擾物質，PAEs是其中重要的一類，暴露于這些物質中是尿道下裂的一個重要發病因素[9]。

2PAEs對Leydig細胞的影響

Leydig細胞是睪丸特異性細胞，大多數哺乳動物在睪丸發育過程中會有兩代不同的Leydig細胞，即胎兒型Leydig細胞(fetal leydig cell，FLCs)和成年型Leydig細胞(adult leydig cell，ALCs)，在人類胎兒期終末階段和嚙齒類動物出生后的第2周，FLCs逐漸被ALCs取代。在胚胎發育后期，睪酮與雄激素受體結合后誘導外生殖器、尿道和前列腺的形成，胚胎期Leydig細胞分泌睪酮能力的降低會對雄性生殖系統產生重大影響。FLCs是胚胎期睪酮的唯一來源，PAEs對Leydig細胞的影響在尿道下裂的發生過程中起很關鍵的作用。

2.1實驗模型張煒等[10]運用DBP成功誘導建立了大鼠尿道下裂的動物模型。目前生理和內分泌領域的比較學研究認為，大鼠暴露于PAEs引發生殖系統出生缺陷的關鍵因素對人類研究具有很高的價值[11-13]，大量尿道下裂的研究都借助于大鼠模型。

2.2PAEs對Leydig細胞形態結構的影響PAEs最顯著的影響是引起Leydig細胞聚集增生，該現象由Parks首次報道[14]。Leydig細胞異常地向睪丸中心位置遷移并聚集在一起，形成一個巨大的病灶，病灶由異常的曲細精管和管內的Leydig細胞組成，并將支持細胞包圍在其中，增生的細胞可能來源于睪丸間質干細胞[15]。在亞細胞水平上，PAEs對Leydig細胞的影響也有很多發現。對孕12～21 d的SD大鼠用100 mg/(kg·d)的DBP進行處理，雄性仔鼠在7周齡大時，其Leydig細胞核大小、延伸率、周邊染色質聚集參數出現增高，但網狀染色質的分布和孤立染色質的聚集參數明顯降低[16]；20周大時，雄性仔鼠的Leydig細胞出現不典型增生，此時光學設備下可觀察到聚集的Leydig細胞出現卵圓狀的細胞核，胞核內有核仁和大量嗜酸性物質，胞質內出現大量游離的核糖體、中間絲、條帶狀內質網等[17]；而內質網隨著小鼠周齡的增長會有不同變化，5～7周齡時，內質網滿布于Leydig細胞內，此后逐漸降低，至17周時消失[18]。在PAEs作用下，Leydig細胞如何產生這些復雜的形態變化及變化的意義都尚未被闡明，還有待進一步研究。

2.3PAEs對Leydig細胞分泌功能的影響Klinefelter等[19]的研究結果表明，PAEs使Leydig細胞聚集增生的同時，睪酮水平也會下降，說明增生并未增加Leydig細胞分泌睪酮的能力。其他研究者也證實，PAEs會降低Leydig細胞的活性，并影響睪酮生成[17-18,20-21]。Li等[22]利用乙烷二甲烷磺酸鹽消除成年大鼠睪丸Leydig細胞，在新生Leydig細胞形成的過程中用PAEs對大鼠進行處理，發現PAES暴露后相對于對照組Leydig細胞數量明顯增多，而睪酮水平降低，Leydig細胞特異性標志物膽固醇側鏈裂解酶Cyp11a1、3β-羥基類固醇脫氫酶1和胰島素樣因子3等均顯著下調，這些標志物的下降也表明Leydig細胞活性受到抑制。PAEs對Leydig細胞功能的抑制作用已形成共識，但事實上，僅高劑量的PAEs會有抑制效應，降低睪酮合成途徑相關酶的基因和蛋白表達[23]，而低劑量的PAEs會促進睪酮的合成[24]。不同的PAEs對Leydig細胞的影響程度也不同，含4～5個碳原子烷基鏈的單酯對睪酮的抑制作用最強，而含0～2個碳原子的最弱[25]。此外，PAEs對Leydig細胞的作用還具有種屬差異，人類和小鼠的敏感性不如大鼠[26-27]。

3PAEs對Leydig細胞的作用機制

PAEs對Leydig細胞的作用機制是近年來研究的熱點，但目前仍未被完全闡明。現在被人們普遍接受的觀點是，PAEs通過干擾膽固醇的調節降低睪酮的生成量。Leydig細胞可直接由血中攝取膽固醇，在線粒體內膜上轉換為孕烯醇酮，進而轉化為有活性的雄激素。在膽固醇向線粒體內膜轉運及雄激素合成過程中有很多關鍵蛋白的參與，如B類1型清道夫受體、類固醇激素合成急性調節蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)、3β-羥基類固醇脫氫酶、細胞色素P450 17A1等。其中B類1型清道夫受體蛋白促進膽固醇進入產睪酮細胞；StAR作為轉運蛋白使膽固醇進入線粒體膜；3β-羥基類固醇脫氫酶是將孕烯醇酮轉化為睪酮的關鍵酶；細胞色素P450 17A1則是睪酮合成酶，將孕酮轉化為雄烯二酮。有研究發現，DEHP及其代謝產物鄰苯二甲酸單-2-乙基己酯的暴露會使Leydig細胞內的StAR、Cyp11a1表達下降[20]，DBP也會產生相同的作用[10]。Cyp11a1編碼生成細胞色素P450膽固醇側鏈裂解酶P450scc，后者參與睪酮生成的第一步酶促反應，將膽固醇轉化為孕烯雌酮[20]，由此推斷，PAEs通過干擾膽固醇的轉運和抑制第一步酶促反應影響睪酮的生成。Johnson等[28]也通過實驗證明，Leydig細胞生成睪酮的急劇衰減是由于膽固醇轉運、睪酮合成路徑相關酶的信使RNA和蛋白(StAR、Cyp11a1等)表達下降；同時，還發現固醇調節元件結合蛋白2表達下降，固醇調節元件結合蛋白2是控制FLCs膽固醇和甾體代謝的基因轉錄因子之一，其活性下降在PAEs的作用機制中也可能起關鍵作用。類固醇生成因子1的活性對FLCs生成睪酮過程中很多蛋白的表達有影響，對男性生殖功能和發育起重要作用，因此，類固醇生成因子1活性下降同樣被認為是PAEs的作用機制之一[29]。進一步研究發現，睪酮生成的最初機制可能是雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子Ⅱ對睪酮生成抑制作用的解除，而不是由旁分泌直接刺激睪酮生成；DBP能夠誘導雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子Ⅱ在FLCs內重新表達，和類固醇生成因子1競爭性地結合于編碼睪酮合成酶基因的啟動子序列交叉反應元件，導致StAR、細胞色素P450 17A1表達下降，影響睪酮的生成[30]。另外，鄰苯二甲酸單-2-乙基己酯還能特異性結合于細胞色素P450 17A1，從而抑制睪酮的合成[31]。氧化應激損傷是另一個重要的作用機制[32]。美國一項研究發現，一般人群尿液樣品中幾種PAEs的代謝產物與血液中炎癥、氧化應激的標志物具有顯著相關性[33]。其他一些研究也發現，PAEs能使細胞中活性氧簇水平上升，導致氧化應激，并通過脂質過氧化作用及損傷細胞中的遺傳物質等方式，對細胞及機體造成氧化損傷[32,34-35]。另外，PAEs能直接作用于Leydig細胞，刺激Leydig細胞的早期增生并延長抑制其分化可能是PAEs對Leydig細胞的作用機制之一，最終影響其功能[22,36-37]。而Lee等[38]對Leydig細胞增生機制進行研究后發現，PAEs能使睪丸內的磷脂酶D顯著增高，而在其他器官(如肝臟、精囊、前列腺等)則無明顯變化，提示PAEs可能通過產生活性氧或其他應激引導激活磷脂酶D，從而導致睪丸Leydig細胞的增生。而雌二醇也被認為能介導PAEs對Leydig細胞的毒性作用，PAEs會導致睪丸內多種蛋白表達改變，其中一些蛋白符合雌二醇調節的通路網絡[19]，但具體的作用機制還不清楚。綜上所述，PAEs對Leydig細胞的可能作用機制有：①干擾膽固醇向線粒體膜的轉運；②影響膽固醇向睪酮轉化的酶促反應；③干擾睪酮合成酶信使RNA的表達；④雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子Ⅱ競爭性地抑制類固醇生成因子1及其下游相關蛋白；⑤氧化應激損傷；⑤抑制Leydig細胞分化；⑦其他。這些機制是近幾年研究的熱點，但有些還不夠完善，有待以后進一步的研究。另外，在研究過程中，一些對Leydig細胞的保護機制也被發現，如DBP作用于大鼠后，過氧化物酶6主要定位于胎鼠睪丸的Leydig細胞中，其可能通過發揮抗氧化作用及刺激Leydig細胞增殖，抵抗PAEs的毒性作用[39]。而轉錄因子NF-E2相關因子2在Leydig細胞氧化應激的過程中則能夠通過核聚集起到保護作用[40]。

4小結

學者們在研究過程中應用了很多新的實驗模型和方法，如用于體外實驗的R2C細胞[25]、大鼠MA-10間質細胞[32,34]和小鼠睪丸間質瘤MLTC-1細胞[23]等，均有很高的價值。利用乙烷二甲烷磺酸鹽消除成熟大鼠睪丸內的ALCs，誘導其再生，避免了大鼠青春期內分泌變化的干擾[15,22,36]。而將人類胎兒睪丸移植入免疫缺陷的嚙齒類宿主中并暴露于DBP，可以為研究PAEs對人類Leydig細胞的作用提供載體[26]。借助這些新的方法，研究PAEs對Leydig細胞作用機制的同時，積極探索Leydig細胞的保護機制，將是以后研究的重點。

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Leydig Cell Influence during the Process of Phthalate Acid Esters-Induced HypospadiasJIANGXu-ping1,SHENBai-xin2,ZHANGWei1.(1.DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China；2.DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011,China)

Abstract:Hypospadias gains more and more attention recently and phthalate acid esters(PAEs),which is widespread in the environment and affects human health seriously,especially the male fertility system,is considered as one of the effect factors.Leydig cell is one of the target cells of PAEs,but the mechanism is still unclear.Here is to make a review of the recent findings about PAEs effects on Leydig cell,and how Leydig cell is affected in the course of phthalate-mediated hypospadias,so as to provide new ideas for the further study and exploration.

Key words:Phthalate acid esters； Hypospadias； Leydig cell

收稿日期：2014-10-08修回日期：2014-12-03編輯：鄭雪

基金項目：國家自然科學基金(81370781)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.001

中圖分類號：R691

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)14-2497-03