多器官功能障礙綜合征動物模型制作方法新進展

朱義超，孫　潔,修光輝，潘興華(綜述)，凌　斌※，朱光旭(審校)

(1.昆明醫科大學第四附屬醫院重癥醫學科，昆明 650021； 2.成都軍區昆明總醫院臨床實驗科，昆明 650032)

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多器官功能障礙綜合征動物模型制作方法新進展

朱義超1△，孫潔1,修光輝1，潘興華2(綜述)，凌斌1※，朱光旭2(審校)

(1.昆明醫科大學第四附屬醫院重癥醫學科，昆明 650021； 2.成都軍區昆明總醫院臨床實驗科，昆明 650032)

摘要：多器官功能障礙綜合征(MODS)是當今危重癥醫學研究的重點，因病死率極高，研究其發病機制是有效治療的根本，建立可重復性經濟標準的動物模型是研究的基礎。國內外對MODS的研究方向不同，所依據的模型制作原理也不盡相同，因此其動物模型的制作方法也有較大差別。該文對MODS的相關動物模型制作方法及優缺點予以綜述，為相關實驗研究提供參考。

關鍵詞：多器官功能障礙綜合征；動物模型；全身炎癥反應綜合征；休克

多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是危重癥醫學中極其常見的一種臨床綜合征，是指在嚴重創傷、感染、休克、大手術、病理產科及心肺復蘇等狀態下，機體同時或相繼發生兩個或兩個以上器官系統功能衰竭的臨床綜合征，病死率極高。盡管現今醫學技術已有了極大提高，但MODS患者的病死率仍達30%～40%，且隨器官衰竭數量增多而增高[1]。作為臨床上的急重癥，其誘發因素較多，治療措施也較為復雜，發病機制也是目前研究的重點。然而成功的模型是進行發病機制、治療措施等研究的關鍵[2]，近來對于MODS動物模型的綜合性研究報道較為稀少，現綜合國際上MODS相關的各類研究，針對MODS動物模型的制作方法進行綜述。

1MODS發病機制概述

MODS的發病過程較為復雜，因此其發病機制也較為復雜，目前主要有“缺血-再灌注”“細菌毒素”“基因誘導”“炎癥失控”等假說。早在20世紀90年代，人們就已經認識到，失控性炎癥反應是MODS的主要機制之一，全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)是MODS發病的基礎，細胞因子失控性釋放是SIRS向MODS轉化的關鍵[3-4]，但具體的調控機制以及作用原理至今不明。因此,如何建立較為標準的動物模型成為前提，只有建立既簡便經濟又可重復性強的標準實驗動物模型，才能更好地對其發病機制進行深入研究，從而探索更好的治療措施，降低病死率，提高治愈率。

2MODS模型的判斷依據

目前國際上MODS的評判主要通過測定動物造模前后相應的器官功能的生理生化指標來評估[5]。通過造模前后對比，利用統計學方法分析其前后各數據的差異是否具有統計學意義。心血管及循環系統用心率、平均動脈壓、肌酸激酶及同工酶、乳酸脫氫酶來代表其功能，相應的肺功能及呼吸系統用呼吸頻率或動脈血氧分壓及血二氧化碳分壓代表，腎臟及泌尿系統用血肌酐、尿素氮以及尿量代表，肝臟、胃腸以及消化系統由轉氨酶、總膽紅素、胃腸活動、腸鳴音等代表，脾臟以及血液、免疫系統由凝血功能、白細胞計數、血小板計數等代表。除此之外，還應觀察動物的基本情況，如體質量變化、體溫變化、精神狀態等。由于近來對SIRS誘發MODS的作用機制較為關注，各類炎性因子(如腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β、白細胞介素6等)水平的測定也成為其參考的指標，這些因子均在造模后顯著升高[6]。其各臟器的病理切片以及免疫組織化學結果也可證實各臟器的損傷情況[2]。

胡森等[7]在20世紀90年代即對MODS的動物模型做過系統的研究，他們根據人的SIRS診斷標準做出動物SIRS的評定參考動物SIRS的診斷依據：心率>2倍對照值，呼吸頻率>2倍對照值或動脈血二氧化碳分壓<75%對照值，直腸溫度較對照值±0.8 ℃，白細胞計數>2倍對照值或<50%對照值。他們還認為，一個符合臨床實際的理想的 MODS實驗模型應具備的標準是：致傷因素與臨床MODS常見誘因基本一致；發病在致傷24 h后；有SIRS的表現；有2個以上器官或系統的功能障礙；有足夠的發病率和病死率。

由于所用動物的各項功能隨飼養品種、飼養的不同也有較大差異，國際上目前也沒有較為統一的動物生理指標參考，因此對MODS的判定結合目前國際主流評定方法，最好采取同等條件下的動物，取造模前后的血液標本和各項生理指標來做對比，對于差異有統計學意義的即可認為其臟器有功能異常，有兩個及以上的臟器功能指標提示異常后即可認定MODS模型符合標準。

3國際常見的MODS實驗動物模型制作

目前國際上通用的，比較常見的MODS動物模型主要有以下幾種。

3.1出血休克模型Yang等[8]通過向大鼠股動脈置管，放掉血容量的40%來模擬出血性休克，失血后的48 h之內，連續記錄評價動脈壓和心率，同時輸入等容積的生理鹽水作為液體復蘇。休克后1、24、48 h檢測生化指標、腫瘤壞死因子α以及白細胞介素6的水平。休克后48 h,取腎、肝、肺和小腸做病理學檢測。出血性休克模型是針對“缺血-再灌注”假說提出的制作方法，出血性休克通過復蘇后會引起一些炎性介質的產生，其中腫瘤壞死因子α和白細胞介素6等都將會引發MODS。該方法較好地模擬了臨床失血性休克、創傷后引發的器官損傷，但此方法對于休克程度的把握要依靠相應的生理轉換儀進行血壓、心率等循環的監測；動物的大動、靜脈置管操作一方面方便放血、回輸，另一方面還要能有效監測循環功能。失血量的計算和控制是模型制作成敗的關鍵，此類方法較為適用于體型較大、血容量較為充足的動物，如兔、豬、犬、猴等。

3.2腸缺血-再灌注模型腸缺血-再灌注模型是鑒于“缺血-再灌注”假說制作模擬的，該方法主要是通過夾閉動物的腸系膜上動脈40～60 min后進行液體復蘇模擬腸缺血-再灌注而引發的MODS[9]。Zanoni等[10]認為，腸缺血和再灌注損傷的大鼠模型是關于腸系膜微循環以及菌群遷移方面在體實驗相對理想的模型，而且該模型平衡了MODS發生和死亡兩個事件的關聯。該模型的制作方法較為一致，可重復性較好，但對動物的創傷較大，要進行較大的開腹、關腹操作，需注意操作的規范以及開腹之后的保溫工作，比較適用于大鼠、小鼠這類體型較小的動物，體型較大的動物的圍術期管理較為復雜，包括麻醉的維持時間的掌控、術中生命體征的維護等，而小型動物相對來說則易于控制。

3.3盲腸結扎穿孔模型目前國際上運用較多的MODS模型中盲腸結扎穿孔占了較大比例，該法通過結扎盲腸后并造成其穿孔來復制膿毒癥模型[11]，各項生化指標檢測前后均顯著升高且大腦皮質、肝、肺、血管系統的組織病理學也均有損傷變化[12]。Daudel等[13]研究認為，微循環障礙是導致組織缺氧和敗血癥多器官功能衰竭的重要因素。該方法綜合了創傷與腸黏膜缺血的雙重打擊誘發器官損傷，在一定程度上也是模擬了一種臨床急重癥的發展誘發的MODS，是對于缺血-再灌注模型的進一步改進，包含腸黏膜的缺血損傷以及膿毒癥打擊。此模型制作也需開腹手術，并確認盲腸位置進行結扎、穿刺等操作，需要研究者對各類動物的解剖結構較為了解，有一定難度，但此類方法手術時間較短，對麻醉和圍術期管理要求較低，適用于各類動物。

3.4大腸埃希菌脂多糖模型依據“細菌毒素”的假說，模擬膿毒癥的臨床發展來引發MODS是近年來做的較多的模型，由于只需向大鼠體內腹腔或靜脈注射脂多糖即可，操作方便，Collin等[14]按照不同的脂多糖濃度(6 mg/kg、20 mg/kg)分組靜脈注射，模擬制作了嚴重內毒素血癥的大鼠，大鼠在6 h 后肝臟出現損傷和功能障礙。Asakura等[15]通過大鼠尾靜脈4 h內注射脂多糖(30 mg/kg)或靜脈持續輸注脂多糖1 mg/(kg·10 min) 10 min來制作大鼠彌散性血管內凝血模型。為了提高MODS的成功率，很多學者又對此進行了改進，結合了以往的一些方法，如Niu等[16]復制了兩次打擊模型，包括腸系膜血管夾閉和脂多糖的雙重打擊。兩次打擊后，天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、尿素氮、肌酐和 乳酸脫氫酶1顯著升高。Qiao等[17]研究發現，靜脈兩次打擊注射脂多糖(98 μg/kg、196 μg/kg)可以重建伴隨多器官損傷的大鼠彌散性血管內凝血模型。但此方法的不足之處即是限于各種動物的質量以及實驗條件，所用的脂多糖劑量差別較大，為6～30 mg/kg 不等，這與大腸埃希菌脂多糖的種類及批次、注射方式、動物狀態等都有關，因此各研究者在做此模型時需要進行前期的摸索，針對所用動物和實驗條件制訂一個適合自己研究的劑量和方法。

3.5酵母多糖誘發炎癥模型近年來越來越多的研究表明SIRS是MODS的關鍵，因此誘發SIRS的動物模型能較好地向MODS方向發展。Goris等[18]在20世紀80年代就創建了酵母多糖誘發炎癥模型，即酵母多糖誘導產生的炎癥模型。將酵母多糖粉劑用高頻磁力攪拌器溶解于液體石蠟中混勻1 h 后100 ℃水浴80 min消毒滅菌，冷卻37 ℃即可按照1 mg/g 的劑量向大鼠或小鼠進行腹腔注射。該模型動物在進展中，肝、腎尤其是肺和脾臟的干濕重隨著病理組織的變化而出現漸變性的變化，老年大鼠比成年大鼠MODS的表現更為嚴重和提前[19]，肺臟、肝臟以及小腸的損傷可以通過生化檢測以及組織學分析判斷[4]。Volman等[20]對之前單純的酵母多糖打擊方案作了進一步的改進，首先進行脂多糖(40 μg)腹腔注射，6 d后腹腔注射酵母多糖(1 mg/g)可以降低在休克第一階段的死亡率，利于MODS的發展。近些年，該模型的酵母多糖用量有所降低，大部分的用量在0.50～0.75 mg/kg[21]。酵母多糖誘發炎癥模型現已經被大量地用于研究多器官衰竭，該模型也因其所用試劑劑量國內外較為統一，且所引起的MODS各項指標變化與人類臨床發病特點相似，被認為是與人類MODS最為類似的動物模型[21-22]。該模型的缺陷也是其優勢所在，即酵母多糖誘發炎癥模型的制作較臨床發病過程有一定偏差，但其也能夠排除其他所有的臨床病癥，直接過渡到全身炎癥失控性爆發這個層面引發MODS，對于MODS在炎癥爆發以及各類炎性因子的作用調控方面的研究較為有利。

3.6其他MODS模型除以上所述各類動物的MODS模型外，還有一些其他制作方法，Lutmer等[23]報道了用燒傷來誘發MODS進行研究，去除小鼠體表面積的25%毛發后進行燒傷處理，也觀察到了多臟器的功能障礙，主要是引起了肺臟的急性損傷。Wang等[24]利用延遲的水母咬傷綜合征原理，通過使用水母素的提取物制作了延遲性水母咬傷綜合征模型，發現也能對各靶器官造成損傷，形成MODS。但這些模型的制作缺乏較多的實驗支持，其模型的穩定性有待驗證。

4展望

當今對于MODS動物模型的制作并無固定統一的做法，但在制作過程中應注意標準的動物模型能夠較好地反映臨床發病特點，所用動物的遺傳同源性也應盡可能接近于人，小鼠與人的同源性可以達到80%，大鼠的更是達到89%～90%[25]。模擬相關重大疾病創傷引發MODS的模型較為傳統，通過引發膿毒癥而引發MODS的模型，是更接近于MODS臨床發生的一種做法，酵母多糖誘發的MODS模型則是對新階段SIRS引發MODS理論的最好研究對象，排除了其他干擾因素，直接從引發全身性炎癥出發。未來對于MODS的研究，或許會更傾向于兩方面的考慮：①盡量模擬臨床發病過程的膿毒癥模型；②更純粹的機制模擬的酵母多糖模型。

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New Progress in Modeling Methods of Multiple Organ Dysfunction SyndromesZHUYi-chao1,SUNJie1,XIUGuang-hui1,PANXing-hua2,LINGBin1,ZHUGuang-xu2. (1.TheIntensiveCareUnitDepartment,theFourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650021,China； 2.DepartmentofClinicalLaboratory，KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryCommandofChinesePLA，Kunming650032，China)

Abstract：Multiple organ dysfunction syndrome(MODS) is the focus of the critically ill study,due to the high mortality,the study of its pathogenesis is fundamental to find effective treatment and to establish repeatable and economic standard animal model is the basis of the research.The direction of research on MODS is different at home and abroad,and the basis of the model making the models is not all the same,therefore the model making methods are varied considerably as well.Here is to make a review of the MODS animal modeling approaches and their advantages and disadvantages,so as to provide a reference for the experiment and research.

Key words:Multiple organ dysfunction syndrome; Animal models; Systemic inflammatory response syndrome; Shock

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-01-08編輯：伊姍

基金項目：國家自然科學基金(81360289，81170316)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.003

中圖分類號：R363

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)14-2502-04