結核分枝桿菌異質性所致的基因耐藥與表型耐藥不一致的研究進展

張麗霞(綜述)，邵世峰(審校)

(國家中醫藥管理局中醫藥防治傳染病重點實驗室 天津市海河醫院檢驗科，天津 300350)

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結核分枝桿菌異質性所致的基因耐藥與表型耐藥不一致的研究進展

張麗霞(綜述)，邵世峰※(審校)

(國家中醫藥管理局中醫藥防治傳染病重點實驗室 天津市海河醫院檢驗科，天津 300350)

摘要：結核病治療和防治是全球性公共衛生問題，治療中抗結核藥物的不規范使用,加上患者的依從性差，造成了結核菌耐藥率不斷增高，成為目前治療上的難題之一。結核菌耐藥有多種原因，其中異質性是結核菌耐藥的一個微小變化過程。臨床檢驗中由于常規方法的局限性無法檢測頻率過低的菌株而造成耐藥結果的偏差，出現了同一標本不同方法藥敏試驗結果不一致的現象，提示結核分枝桿菌的異質性對藥敏結果有影響。

關鍵詞：結核分枝桿菌；異質性耐藥；表型耐藥；基因耐藥

當前，耐藥性問題是結核病最重要的問題之一,特別是耐多藥結核病、嚴重耐藥結核病的出現給結核病的治療帶來了更大的困難[1]。世界衛生組織估計約2/3的結核病患者處于耐多藥的危險之中[2]。所以，藥敏試驗的正確判斷和耐藥監測對結核病控制和流行病學統計起著重要作用。因此，研究結核菌耐藥機制，掌握各種檢測方法的特性，快速、準確地給臨床提供治療依據是每個實驗室工作者追尋的目標。傳統的結核菌檢測方法具有金典性，但隨著基因檢測技術的發展，結核菌快速鑒定和藥敏試驗為患者治療提供了更為有利的條件。目前結核耐藥基因技術已走向臨床，對結核患者進行快速篩查和藥敏分析已成為必然趨勢，現就基因耐藥和表型耐藥結果不一致現象予以綜述。

1結核分枝桿菌基因的研究

傳統的結核菌基因分型技術以核酸為主，從表型特征上認識細菌，主要有噬菌體分型、血清分型、藥物敏感試驗分型、細胞蛋白電泳、生物化學多樣性分析等。隨著科技的進步和方法學的變化，目前多采用限制性片段長度多態性、間隔區寡核苷酸分型技術、可變串聯重復序列技術、單核苷酸多態性分析、長片段多態性等來分析。限制性片段長度多態性方法具有較高的分辨率和菌株鑒別的能力；間隔區寡核苷酸分型技術是基于染色體上直接重復區位點的多態性，方法簡便、重復性高、只需少量DNA，被公認為北京家族菌株鑒定的金標準[3]；可變串聯重復序列技術被美國疾病預防中心推薦為結核分枝桿菌基因分型的首選方法，其操作簡便、快速、成本低，以聚合酶鏈反應為基礎，也被稱為可變串聯重復序列技術[4]。目前采用的線性探針檢測技術可檢測出結核分枝桿菌的rpoB、katG、inhA、ahpC、kasA、ndh、OxyR-ahpC、mabA-inhA、furA-katG、fabG-inhA以及編碼外排泵蛋白質的efpA、iniA、iniB、 iniC基因等[5]。近年來，隨著分子生物學技術日趨成熟，對結核分枝桿菌的基因及耐藥機制進行了更加深入的研究，定位了結核分枝桿菌耐藥基因的位置、基因突變位點和藥物的關系來判斷耐藥性，使人們對結核病的流行特點和傳播有了更深刻的理解和掌控。

2耐藥的概念、機制與檢測方法

2.1耐藥的概念及機制結核病分為直接感染耐藥結核菌引起的原發耐藥和結核分枝桿菌菌株基因組發生突變而產生的獲得性耐藥[6]。原發性耐藥指從未因結核病而被治療過的患者，或曾因結核病被治療過但少于1個月的患者，他們帶有一種或多種抗結核藥物耐藥結核分枝桿菌；而獲得性耐藥是指結核患者開始接受抗結核藥物治療后，在治療過程中結核分枝桿菌產生一種或多種抗結核藥物的耐藥性[7]。目前結核桿菌發生耐藥的機制可從細胞水平與分子水平來分析，細胞水平的耐藥機制與結核桿菌對抗結核藥物的耐藥概率、療效、病灶中細菌數量及藥物種類的應用有直接的關系，病灶中結核桿菌數量越大，突變概率越大，耐藥的機會也越多[8]。單一用藥耐藥的概率大于聯合用藥，用藥數量越多、耐藥的機會越少，耐多藥結核病的發生率也越低[9]；分子水平上的耐藥機制與細胞膜通透性、產生降解或滅活酶類、藥物的作用靶位相關[10]。另外，染色體突變介導的藥物靶編碼基因的各種突變基因，是結核分枝桿菌耐藥的主要分子機制[11]。

2.2檢測方法目前我國檢測結核分枝桿菌藥敏試驗的方法主要有傳統的固體檢測法(包括比例法、絕對濃度法和耐藥性法)和現代的快速培養儀系統(常用的有全自動分枝桿菌檢測儀、全自動血培養儀及顯微鏡觀察藥物敏感性檢測)[12]；近代的線性探針技術、基因芯片測序等技術也逐步應用于結核病快速診斷和耐藥基因突變的臨床檢測中[13]。各種方法都有各自的敏感性和特異性，由于操作者不同而存在較大差異。絕對濃度法在判斷上未對“敏感”和“耐藥”下明確定義，僅記錄培養基上菌落生長的豐度來報告，結果不直觀，人為因素多，給藥敏試驗室間質控帶了困難；相比之下，比例法對藥物敏感試驗中接種量進行了校準，它采用了兩種菌液濃度(10-2mg/mL和10-4mg/mL)，通過計算活性單位的比值獲得，使結果更加精準，定義1%為“敏感”和“耐藥”的臨界點[14]。全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統是目前常用的液體快速檢測方法，該方法在分枝桿菌生長指示管底部包埋熒光感應器，對培養基內溶解的氧氣敏感，加入標本孵育后若無細菌生長培養基內大量的氧氣抑制熒光感應器發出熒光，儀器檢測為陰性；如有細菌生長則消耗培養基內氧氣，激活熒光感應器發出熒光，儀器檢測熒光強度增強，儀器檢測為陽性，一般在標本培養后的4～12 d內報告陽性結果。自動液體培養系統比傳統固體培養基顯示了較好的敏感性和檢測快速的優點[15-16]。但由于藥敏種類少不能更好地滿足臨床需求，不能有效篩查嚴重耐藥結核病菌株，所以也同時使用傳統的固體培養法對二線藥及氟喹諾酮藥物的監測，因此也就出現了在實際工作中遇到的同一標本，同一種藥物兩種方法藥敏結果判斷不一致的現象。對此，O′Grady等[17]報道，通過不同藥敏測試方法在檢測時間、準確性、實用性、菌液濃度等方面的比較得出，結果不符的原因可能與菌株低水平的耐藥有關，也可能是因為該菌落中耐藥和敏感的亞群比例不同。宿主的多態性、結核菌敏感和耐藥的數量或菌種的異質性是造成細菌是否耐藥的主要原因[18-19]。

3結核分枝桿菌異質性耐藥的產生

異質性耐藥是指在同一標本中同時存在敏感菌和耐藥菌的現象，這體現了細菌群體從部分耐藥向完全耐藥的微小轉變過程。臨床標本中存在同一患者相同時間分離的標本液體法和固體法藥敏結果不一致的現象，究其原因是實驗室污染、多重感染、異質性耐藥、檢測方法問題或是細菌本身對藥物敏感性不均一問題，這些問題的存在對結核病的耐藥性診斷及治療提出了挑戰。目前國內外對同一患者同次送痰的兩種方法藥敏結果不一致的菌株進行分析的文獻還較少，有學者報道用高通量測序技術研究了結核患者體內結核分枝桿菌異質性耐藥的發展過程，發現在異煙肼耐藥性產生的早期同一細菌菌體中同時存在4～5種與異煙肼耐藥相關的突變，證明了異質性耐藥的真實存在[20-21]。

4研究異質性耐藥結核分枝桿菌的臨床意義

異質性耐藥是從敏感菌向耐藥菌轉變的過程，研究異質性耐藥能加深對耐藥結核病發生、發展過程的認識，異質性耐藥標志著細菌突變數量的多少和用藥劑量的大小。在進行耐藥性評價時，不僅要考慮到方法學的差異，還應考慮是否存在多重感染、繼發感染及混合感染等。因此，臨床上在進行藥物敏感性監測時要選擇靈敏性高的診斷方法，對耐藥菌特別是適應性高的耐藥菌篩查要注意方法的敏感性，盡早采用先進的基因技術預測藥物的敏感性，避免異質性耐藥的出現造成結果的偏差和誤導治療方案的確立；同時，了解其耐藥程度，采取個體化用藥，真正有效控制耐藥結核病的傳播，防止和延緩結核菌向耐多藥、嚴重耐藥發展。另外，異質性耐藥又存在于結核菌初始變化過程中，研究異質性耐藥對評估結核病療效也具有重要意義。對結核分枝桿菌異質性耐藥的認識以及是否在臨床中采取不同的治療措施[22]，在細菌群體數量較少的時候進行個體化治療，來降低耐藥細菌的產生，還有待大量臨床數據的支持和研究[23-25]。

5小結

比例法、絕對濃度法和全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統、全自動血培養檢查系統以及顯微鏡觀察藥物法、線性探針、基因測序、結核分枝桿菌/核酸檢測等技術都在不同階段為結核病的控制和治療起著重要作用。異質性耐藥是細菌對抗抗生素的一個效應過程，也是對治療方案的選擇、療效評價的一個驗證。研究結核菌的異質性耐藥，必將為早期發現結核病、減緩結核菌耐藥起到積極作用。

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Research Progress of Inconsistent Results Caused by the Heterogeneity of Mycobacterium Tuberculosis Gene and Phenotypic Drug ResistanceZHANGLi-xia，SHAOShi-feng.(KeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControlofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinHaiheHospital，Tianjin300350，China)

Abstract：Tuberculosis(TB) treatment and prevention is a global public health problem,due to the irregular use of anti-TB drugs,plus poor compliance of the patients,TB drug resistance is increasing continuously,and has become one of the difficulties in clinical.There are many causes of TB drug resistance,and heterogenicity is a small change process,where clinical testing cannot detect low frequency drug-resistant strains because of the limitations of conventional methods,resulting in inconsistent results of the same specimen by different tests,which indicates heterogeneity influences on the drug sensitivity test.

Key words:Mycobacterium tuberculosis; Heterogeneous resistance; Phenotypic resistance; Gene resistance

收稿日期：2014-10-29修回日期：2015-01-16編輯：鄭雪

基金項目：天津市衛生局課題(2014K2035)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.012

中圖分類號：R446.5

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)14-2526-03