上皮細胞黏附分子與腫瘤診斷及治療的研究進展

張敏娜 楊永平 貌盼勇

上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)，按白細胞分化抗原命名為CD326，是最早在結腸癌中發現的一種跨膜糖蛋白，也是第1 個用單克隆抗體技術鑒定出來的人腫瘤相關抗原。Ep-CAM 除了在健康個體的上皮細胞表達，還在大多數人類腫瘤中不同程度地過表達。并被多項研究證實與腫瘤的診斷和預后判斷密切相關。而且，EpCAM的過表達已在EpCAM 抗體及以疫苗為基礎的多種腫瘤的臨床實驗中被開發和應用。本文就EpCAM與腫瘤相關性的研究進展綜述如下。

一、分子結構

EpCAM 是細胞膜表面的一種跨膜糖蛋白。由位于4q 染色體上的GA733 -2 基因編碼。也有報道認為EpCAM 由位于人染色體2p21 上的TACSTD1(tumor-associated calcium signal transducer protein 1-precursor)編碼。其實，這兩個基因在基因庫中的序列完全一致，為同一個基因編碼。EpCAM 的基因長度為14kbp，成熟的mRNA 為1.5kbp，人和鼠的EpCAM 核苷酸80%同源，氨基酸序列82%同源，說明EpCAM 在進化中高度保守。EpCAM 的相對分子質量為40kDa，由314 個氨基酸構成。其分子由胞外段結構域(EpEX)、單次跨膜結構域和胞內段結構域(EpICD)構成［1］。EpEX(N 端)由242 個氨基酸構成，其所包含的表皮生長因子樣重復序列和甲狀腺球蛋白結構域是同型分子間黏附的結構基礎。跨膜段結構域由23 個氨基酸殘基構成，C 端的胞內段結構域由26 個氨基酸殘基構成，具有2 個α -輔肌動蛋白結合位點，可以與肌動蛋白結合，從而和細胞骨架相互作用。而且EpICD 對于EpCAM 依賴的由漿膜至胞核的信號轉導也至關重要，EpICD 通過膜內蛋白水解，起到部分轉錄復合體的作用，誘導c -myc、細胞周期蛋白A 和E 的表達［2］。

二、EpCAM 的信號轉導通路

1.調節的膜內蛋白水解作用:EpCAM 的寡聚化形式是信號轉導的啟動子，使EpCAM 被蛋白酶水解，釋放其細胞內結構域。2009 年，Munz 等的研究顯示，細胞質、核周和核內存在點樣EpICD 染色，而在細胞黏附部位的EpCAM 常丟失胞內域，說明細胞間的接觸部位存在調節的膜內蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis，RIP)作用誘導的信號轉導。RIP 包括配基誘導的EpEX 的脫落和EpICD 的釋放。脫落的EpEX 和(或)EpICD 能夠活化信號事件，誘導腫瘤細胞增生，而EpCAM 裂解也可引發對于自身表達的正反饋循環。在甲狀腺癌、乳腺癌中，EpICD 核表達被認為與侵襲性的腫瘤類型、生存期縮短等不良預后有關［3～5］。另外，最近研究證實，EpCAM 的胞外域還存在另外幾個裂解位點，這提示EpCAM 信號被不同的蛋白水解通路調節，可能涉及控制EpCAM 的多種功能［6］。

2.EpCAM 與Wnt-β -catenin 信號通路:Wnt -β- catenin 信號通路為經典的腫瘤信號轉導通路。Yamashita 等［7］研究顯示，EpCAM 為Wnt -β -catenin 通路的直接轉錄靶點，通過RNA 干擾沉默Ep-CAM 表達或抑制β-catenin，可導致EpCAM 表達陽性的肝癌細胞死亡。而激活Wnt -β -catenin 信號通路則會使EpCAM 陽性的肝癌細胞數量增加。

3.EpCAM 與PI3K 通路:2007 年，Litvinov 等通過對乳腺上皮細胞HBL100 的研究顯示，3 -磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3 -kinase，PI3K)可調節P85 亞基在EpCAM 與N - 鈣黏素間的穿梭。Ep-CAM/p85 復合體具備激酶活性，而PI3K 的激活可促使細胞進入DNA 合成期，使細胞發生癌前轉化的特征性改變，PI3K 活化也是誘導細胞增生和細胞間黏附所必需的。以上結果表明，EpCAM 可能通過PI3K通路發揮對細胞增生的部分調節作用［8］。

三、EpCAM 表達譜

EpCAM 在生理條件下廣泛表達于上皮源性的正常組織(包括胃囊、結腸、胰腺、膀胱、前列腺、乳腺、卵巢、皮膚汗腺等)的基底外側膜。而神經內分泌組織、間葉組織及部分上皮來源的腺上皮(如肝細胞、胃壁細胞、上皮角化細胞、肌上皮)則不表達EpCAM。在病理情況下，EpCAM 在部分發生癌前病變的上皮組織表達轉為陽性(如不典型增生的口腔黏膜、食管化生上皮、急慢性活動性肝炎、子宮頸不典型增生)或表達明顯增強(如結腸腺瘤)［1］。EpCAM 在頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、結直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺鱗狀細胞癌及皮膚基底細胞癌等上皮源性腫瘤中高水平表達，而在間質或外胚層來源的腫瘤(肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤)不表達［1］。

四、生物學功能

1.調節細胞間黏附及遷移、調控細胞形態:Ep-CAM 主要介導非鈣離子依賴性的同源細胞之間的黏附，這種黏附作用較E -鈣黏蛋白(E -cadherin)松散。在生理條件下，EpCAM 通過重排細胞肌動蛋白骨架來實現對細胞運動的調節，可能有促進細胞遷移的作用。另外，EpCAM 還通過對細胞形態的調控參與上皮組織的發生、發展及腫瘤的成瘤及進展。

2.調節細胞周期和細胞增生:EpCAM 對細胞周期和細胞增生均有影響［9］。當把EpCAM 的全長cDNA 轉染到EpCAM 陰性的HEK293 細胞后，HEK293細胞表達EpCAM，細胞周期調節基因cyclin A/E 及其蛋白、c-myc 基因快速上調表達而促進細胞的代謝及增生。EpCAM 也通過Wnt 信號通路參與細胞增生過程［10］。而且，EpICD 的蛋白水解裂縫(proteolytic cleavage)被證實提供有絲分裂信號。另外，EpCAM還可通過在轉錄水平調節細胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達并通過與FHL2(four and half LIM domains-2)作用的能力來直接影響細胞周期［11］。

3.參與惡性腫瘤的發生、發展:EpCAM 過表達可能激活與腫瘤發生有關的Wnt 信號途徑。另外，Ep-CAM 通過促進Th2 分化阻斷樹突狀細胞的MHCⅡ限制性抗原遞呈，產生的CD4+T 細胞部分功能缺陷，使腫瘤細胞逃逸CD4+T 細胞依賴性的免疫反應而促成腫瘤進展［12，13］。在宮頸鱗狀上皮及前列腺中，EpCAM 的表達從正常上皮、經由上皮內瘤形成到癌形成均顯著增加。在胃癌、乳腺癌、肝癌、舌鱗狀細胞癌中，過表達EpCAM 的腫瘤細胞具有增生活性高及侵襲性強的特點，通過RNA 干擾下調EpCAM 表達能夠降低細胞的增生、遷移和侵襲能力［14，15］。這些結果進一步證實了EpCAM 促進腫瘤發生、發展、侵襲方面的作用。但是，有些研究卻顯示EpCAM 的表達在某些情況下對抗腫瘤的生長和轉移。鼠結直腸癌細胞轉染EpCAM cDNA 后，增加了細胞間黏附，減弱了腫瘤細胞在基質膠的侵襲，當預先注入鼠的脾臟時減少了腫瘤的發生和轉移［16］。此外，EpCAM 在不同腫瘤的預后判斷中起到不同的提示作用。在膀胱癌、膽囊癌、胰腺癌、低分化乳腺癌、肺鱗癌中，EpCAM 高表達與淋巴結轉移、腫瘤分期晚和低分化等不良預后因素有關［17］。而在口腔鱗癌、食管癌、低分化甲狀腺癌、腎透明細胞癌中，EpCAM 則是腫瘤預后良好的標志，與患者生存期延長相關［18］。EpCAM 擔當抑癌基因或致癌基因的角色可能取決于微環境。由于外在的調節與EpCAM 的異常表達有關，根據腫瘤類型上調或下調EpCAM 的表達，可能成為新的、有潛力的腫瘤治療方法。

五、EpCAM 與腫瘤的診斷

1.EpCAM 為腫瘤干細胞標記:EpCAM 于2008年被鑒定為人胚胎干細胞標記。其后多項研究證實了EpCAM 為鼠及人胚胎干細胞的多能性及增生性的標記。近年來，直結腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等的研究結果均證實EpCAM 可作為腫瘤干細胞的標志［19］。在肝癌的研究中，EpCAM+的肝癌細胞也同時表達其他肝干細胞標記，具備自我更新和分化能力及較高的侵襲性，能夠在NOD/SCID 小鼠(非肥胖糖尿病聯合免疫缺陷小鼠)中有效誘生高侵襲性的肝癌。2008 年Yamashita 等［20］依據EpCAM 及AFP 的表達情況將肝細胞癌分為具有預后提示信息的4 型，即膽管上皮樣肝癌(EpCAM+AFP-)、肝干細胞樣肝癌(EpCAM+AFP+)、肝祖細胞樣肝癌(EpCAMAFP+)、成熟肝細胞樣肝癌(EpCAM-AFP-)。其中，肝干細胞樣肝癌具備肝癌干細胞樣特性，患者年齡小，TNM 分期晚，伴門脈受侵，預后差。

2.EpCAM 陽性的循環腫瘤細胞檢測技術:Ep-CAM+的循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)擁有干細胞特性，能夠在原發組織重新種植或轉移至遠處臟器，與總的CTC 相比能夠提供更多的臨床預后信息［21］。目前EpCAM+的CTC 的檢測技術包括以整個細胞為基礎的技術方法(免疫組織化學、免疫磁性分離、流式細胞術等)和以核酸為基礎的技術方法。其中基于免疫磁性分離原理發展起來的Cell Search 系統，只需應用7.5ml 血液樣本即可從400 多億的血細胞中檢測到1 個CTC，敏感度較高。已被美國FDA 批準應用于臨床，目前主要應用于預測轉移性乳腺癌、結直腸癌或前列腺癌的無病生存期和總生存期。臨床應用結果表明，通過Cell Search 系統檢測CTC 可判斷療效及評估患者預后，并具備無創、簡便、易行的特點，可對同一患者進行連續監測。2012年，Sun 等［22］首次應用Cell Search 系統對肝癌患者CTC 進行檢測，結果顯示CTC 在HCC 患者中檢出率為66.67%。術前CTC7.5≥2 為腫瘤復發的獨立預后因素。EpCAM 陽性CTC 作為肝細胞癌的不良預后因素也被Schulze 等［23］的研究證實。之后在此基礎上發展起來的微流體芯片分離技術較Cell Search系統更敏感。Cell Search 系統和微流體芯片技術因其檢驗對象是血液標本，無需通過有創手段取得實體腫瘤組織就可進行組織病理學檢查，故又被稱為“液體活檢”(liquid biopsy)，有望在臨床上普及使用［24］。以核酸為基礎的技術方法主要通過多聚酶鏈反應法(PCR)在外周血標本中檢測癌細胞EpCAM 的mRNA來間接提示EpCAM+CTC 的存在。該研究方法檢測的敏感度較高，但特異性略差。且不能進行細胞形態學及功能等方面的研究［25］。

六、EpCAM 抗體的治療應用

目前，已開發的EpCAM 抗體主要應用于上皮源性腫瘤治療的探索。

1.單克隆抗體:包括鼠源性IgG2a 抗體(edrecolomab)、1 個鼠嵌合IgG1 抗體和全人源IgG1 抗體(3622W94，ING -1，adecatumumab - MT201)。其中edrecolomab(ED)是第1 個用于治療人類胃腸道腫瘤的單克隆抗體，并顯示出延長整體生存期的臨床療效，已在德國上市。但隨著臨床治療的應用，發現ED對實體瘤的治療效果有限，而對術后輔助治療有一定的幫助。其安全性良好，但存在半衰期短、鼠抗人單克隆抗體快速中和反應和臨床作用不明確等缺陷。adecatumumab(MT201)介導補體依賴和抗體依賴的細胞毒性反應。與ED 相比，此抗體具有不良反應較小、體外試驗顯示更強的抗體依賴性細胞毒性反應的特點。在轉移性乳腺癌患者的Ⅱ期臨床試驗中，MT201 顯示出劑量及靶點依賴性的臨床效應，并且使新的轉移灶發生減少。EpCAM 表達陽性的卵巢癌細胞株對MT201 介導的ADCC(抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用)高度敏感，白細胞介素-2 能增強MT201 對EpCAM+卵巢癌的細胞毒性作用。

2.雙特異性三功能抗體:catumaxomab 能夠同時特異性識別并結合EpCAM 陽性腫瘤細胞及CD3+T細胞，并通過其Fc 段形成ADCC 效應細胞、腫瘤細胞、T 細胞復合體，觸發誘導腫瘤細胞凋亡的多種免疫機制。2009 年4 月，catumaxomab 被歐盟委員會批準應用于EpCAM 表達陽性腫瘤患者的惡性腹腔積液的治療，顯示出僅次于上皮癌的臨床獲益。Strohlein 等應用catumaxomab 治療消化道源性的腹腔腫瘤，隨訪2 年結果顯示，65%患者無進展生存，1例完全緩解，3 例部分緩解，取得了延緩疾病進展、延長生存時間的療效。卵巢癌及胃癌并惡性腹腔積液的臨床Ⅲ期實驗顯示其有效減少腹腔積液產生、延長整體存活時間的確切的臨床效果。近期，Jagern 等分析治療后的腹腔液體樣本結果顯示，治療組腫瘤細胞數目和VEGF 水平均降低，激活CD4+和CD8+T 細胞群數量增高2 倍，值得關注的是，治療組樣本中CD133+和EpCAM+腫瘤干細胞消失。

3.EpCAM 的其他治療應用:在肝癌的靶向治療方面，Ogawa 等新近的研究顯示，以EpCAM 為靶點的抗毒素VB4 -845 與5 -FU 聯用在肝癌細胞系中顯示出強效的細胞毒性，而且VB4 -845 顯著抑制肝癌細胞的克隆形成能力及肝干細胞標記(CD133、CD13)的表達。體內試驗顯示，5 -FU 與VB4 -845聯用顯著縮小肝原位移植物模型的腫瘤體積。說明EpCAM 靶向治療有望成為預后較差的肝細胞癌的新的治療方式。

4.治療策略中的相關問題:以EpCAM 為基礎的腫瘤治療策略是否影響正常上皮組織和干細胞?正常上皮組織和干細胞與腫瘤細胞EpCAM 表達水平及表達形式的差異又是否允許抗EpCAM 靶向治療?基于EpCAM 的靶向治療之所以可行，考慮與以下因素有關。(1)抗體親和力:edrecolomab 和adecatumumab 及中等親和力的人源型抗體MT201 的治療耐受性良好。而親和力最高的抗體，如3622W94 和ING-1 即使在低濃度(1mg/kg 體重)下也誘發急性胰腺炎。說明適宜的抗體親和力為靶向治療可行的因素之一。(2)EpCAM 的表達部位:EpCAM 低水平表達于大多數正常的人上皮組織的基底外側膜，但在癌細胞則高水平地表達于膜頂部，更容易被抗體接近。這種亞細胞水平的分布差異使EpCAM 成為非常合適的腫瘤治療靶點。(3)正常組織與腫瘤組織EpCAM 表達形式的差異:如糖基化、甲基化、共表達蛋白等。在正常組織，EpCAM 與CD9、CD44 和Claudin -7 同在一個復合體內，并位于基外膜。這樣，EpCAM 結合抗體的親和力在正常細胞就比腫瘤細胞低。而且，在治療性抗體的生產過程中能夠發生與細胞毒性有關的糖類物質成分的變化，可以解釋抗Ep-CAM 抗體治療的安全范圍內的不良反應。但治療性抗EpCAM 抗體仍存在較多的不良反應，甚至誘發胰腺炎等嚴重并發癥。因此，目前臨床上保守地局部應用抗EpCAM 抗體治療，不失為最大限度地限制系統性不良反應的方法之一。

雖然EpCAM 分子相關的腫瘤免疫治療發展很快，但臨床應用仍很局限。如何將EpCAM 與腫瘤的分子靶向治療結合，并最大限度降低藥物不良反應使其臨床可行，有待于今后進一步研究和探討。

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