滑膜間充質干細胞在軟骨修復領域的研究進展

鄭偉偉 楊 民

關節軟骨是一種透明軟骨，由特殊的致密結締組織膠原纖維構成基本框架，在這些纖維之間，散在分布著軟骨細胞，而這些軟骨細胞的功能則是維持關節軟骨的正常代謝。關節軟骨承受力學負荷，沒有神經、血管支配，一旦損傷后難以自行修復。目前軟骨修復的治療主要是自體軟骨移植，但其來源有限，不能用于廣泛修復。間充質干細胞的出現為再生組織工程提供了新了視野。研究證實，滑膜間充質干細胞(synovial mesenchymal stem cells，SMSC)較其他來源的間充質干細胞具有更強的成軟骨能力［1］，越來越引起人們的重視。

一、SMSCs 的來源及形態學特征

滑膜組織中間充質干細胞含量豐富，僅需少量滑膜即可收集SMSC，研究表明，將滑膜組織移種到培養皿中培養兩周后，1mg 滑膜組織可收集到21000 個細胞［1］。滑膜組織除可在健康人體內獲取外，類風濕關節炎(RA)或退行性骨關節病(OA)患者也可成為其來源，并且滑膜組織可再生，可通過關節鏡獲取。

相差顯微鏡下，SMSC 呈均一的小梭形細胞狀，胰酶消化后細胞直徑為10 ～15μm，細胞核較大，圓形，有明顯的核仁。低密度培養時細胞呈纖維細胞樣。SMSC 體外培養分為動態培養和靜態培養，與靜態培養相比，動態培養在更短的間內可分離出更多的SMSC，但其缺點是可能會夾雜其他間充質干細胞［2］。根據形態，滑膜細胞主要分兩種:巨噬細胞樣細胞和成纖維細胞樣細胞［3］。巨噬細胞樣細胞可能與先天性獲得性免疫有關，成纖維細胞樣細胞則產生滑液。SMSC 來源于成纖維細胞樣細胞［4］。實驗發現成纖維細胞樣細胞增殖能力較強，培養兩周后細胞群中幾乎全部都是B 型細胞。

二、SMSC 的生物學特征及免疫表型

SMSC 做為成體干細胞的一種，具有自我增殖能力和多向分化潛能。SMSC 在體外傳至10 代以上仍保持良好的生長狀態，屬穩定傳代的細胞系［5］。SMSC 可向成脂、成骨、成軟骨、成肌腱纖維分化，尤其是向軟骨分化方面更具潛力。

SMSC 免疫表型與BMSC 相似，均表達CD10、CD13、CD14、CD34、CD44、CD45、CD49a、CD62e、CD73的表達均為陽性;但第1 代細胞CD14、CD34、CD45、CD62e 和HLA-DRA 表達為陰性［6］。張正政等［7］研究發現人第2 ～6 代SMSC 具有相似的免疫表型，均表達CD90、CD44、CD105，不表達造血細胞表面抗原CD34、CD45。此外SMSC 均不表達HLA - DR 以及CD14。但以上研究并未發現SMSC 的特異性標志物。

三、SMSC 向軟骨分化的優勢

Yoshimura 等［5］通過比較肌肉、脂肪、滑膜、骨膜和骨髓來源的間充質干細胞，發現SMSC 較其他間充質干細胞具有更強的增殖能力，在向軟骨分化的能力上，SMSC 也明顯優于其他間充質干細胞。并且，滑膜細胞和軟骨細胞均來源于共同的祖細胞群，當關節軟骨存在部分缺失時，鄰近的滑膜組織會向缺損處生長覆蓋，有助于軟骨修復。另外，MSC 體外培養后具有免疫抑制效應，可用于MSC 的同種異體移植［8］。

四、SMSC 與誘導因子

近年來的研究顯示，轉化生長因子(TGF -beta)超家族、骨形成發生蛋白(BMP)家族、堿性成纖維生長因子(bFGF)、胰島素生長因子(IGF -1)等均能促進SMSC 增殖和向軟骨細胞分化，其中TGF -beta 和BMP-2 協同促進SMSC 成軟骨的作用尤為突出［9］。有研究表明，Rho A/Rho 激酶通路的激活調控了TGF-beta 誘導的軟骨細胞相關蛋白的轉錄和細胞骨架結構的形成，這一發現對于體外誘導SMSC 分化為軟骨細胞具有重要指導作用［10］。此外，Kim 等［11］認為TGF- beta1 可上調軟骨細胞基因表達是通過增強Sox9 基因的表達，他們將TGF -beta1 通過重組反轉錄病毒轉染入SMSC，轉染后的SMSC 持續表達TGF-β1，通過流式和RT -PCR 證實過量的表達的TGF-β1 不能引起細胞表面發生改變。在體外誘導成軟骨，發現持續表達的TGF-β1 不但增強了SMSC增殖能力還提高了SMSC 成軟骨能力。

除生長因子外，培養基中的離子含量也影響著間充質干細胞的增殖及向軟骨組織分化。Dry 等［12］通過研究發現，適當提高培養基中的Ca2+，可提高SMSC 增殖率，但不能促進其向成骨、成軟骨、成脂方向分化。然而，在Ca2+＞1.8mmol/L 時，兔的BMSC增殖率不受其影響［13］。當Ca2+＞0.6mmol 時，Ca2+對小鼠神經前體細胞的增殖不產生影響［14］。Ca2+＜5.0mmol/L 時，其對豬成骨細胞增殖率無影響，但Ca2+＞5.0mmol/L 時起抑制作用［15］。但與當前研究相反的是，人類ADSC 在Ca2+＜0.9mmol/L 時，表現出增強的生長態勢［16］。盡管多項研究表明Ca2+可以增強很多哺乳動物細胞的生長速率，但Ca2+對細胞的影響并不一致，這可能與細胞的類型和細胞來源有關。

此外，軟骨細胞上清液也可誘導SMSC 的成軟骨分化。邵博等［17］通過將軟骨細胞上清液加入微團培養的SMSC 管中，微團培養21 天后可見似軟骨樣組織，免疫組化、real time -PCR 檢測結果顯示誘導后的微團表達Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖，誘導的產生可能與軟骨細胞分泌的一些細胞因子有關。

五、SMSC 與載體材料

將SMSC 種入材料上固定在軟骨缺損部位，從而促進軟骨細胞和基質的生成。然而，植入材料修復與天然組織相比仍具有較大的差異。軟骨基質富含Ⅱ型膠原蛋白和硫酸糖胺聚糖，SMSC 通過誘導能合成大量的軟骨基質。將SMSC 種植在含有纖維蛋白凝膠的聚乙醇酸網中培養1 個月，產生了大量軟骨細胞特異性的Ⅱ型膠原蛋白和硫酸糖胺聚糖［18］。

Chang 等［19］發現將人的SMSC 與人脫細胞關節軟骨基質(ACM)混合培養，通過RT-PCR 發現ACM單獨可誘導SMSC 表達Ⅱ型膠原，加入誘導因子的ACM 可改善SMSC 成軟骨后的過度增殖導致再生組織肥大等問題。ACM 可成為軟骨組織工程的載體材料，這一發現可能為SMSC 種入體內過度增殖而引起再生組織肥大等問題提供解決思路。Pei 等［20］通過研究發現SMSC 來源的去細胞基質(DSCM)不但可以在體內、體外促進SMSC 增殖，還可以促進細胞向軟骨細胞分化。此外，富血小板血漿(PRP)也可成為軟骨缺損的組織工程支架，Lee 等［21］將SMSC 植入PRP內，種入兔軟骨缺損模型，24 周后成功修復兔軟骨缺損模型。但Lee 等［22］通過研究發現富血小板血漿(PRP)對SMSC 三系分化起著負面作用，并證實PRP 單獨應用不能誘導SMSC 分化。而Elder 等［23］也證實，PRP單獨應用不能促進骨髓間充質干細胞成軟骨。

Lee 等［24］將SMSC 植入Ⅰ型膠原/透明質酸/纖維蛋白原(COL/ HA/ FG)復合凝膠中，注射入兔膝關節軟骨缺損模型中，24 周后通過番紅O 和免疫組化染色復合凝膠產生透明軟骨結構，這項研究表明Ⅰ型膠原/透明質酸/纖維蛋白原(COL/ HA/ FG)復合凝膠是一個很好的用于修復軟骨缺損的材料。Shao等通過噬菌體展示技術證實了一個含有7 個氨基酸的肽序列與SMSC 具有很高的親和力，他們將這種肽序列通過共價偶聯結合聚己內酯電紡網格和人類脫鈣骨支架材料表面，將其與SMSC 共培養24h，發現實驗組中的SMSC 數量較對照組有明顯增加，這項研究廣泛適用于SMSC 為種子細胞的組織工程。

盡管通過MSC 進行體內修復已達到可接受的臨床效果，但修復后的組織相較于天然組織而言，其機械性仍然較差［25］。將種子細胞誘導成為與正常軟骨組織相當的工程組織尚需時日。種子細胞的過度增殖是再生組織工程經常遇到的問題，在缺損部位植入更多的細胞會收到更好的效果，因為有些細胞會被吸收或不能分化。將人的SMSC 種植在人脫細胞關節軟骨基質(ACM)誘導成軟骨也可降低細胞過度增殖導致再生軟骨肥大等問題［19］。

六、SMSC 與相關疾病

在半月板修復中，Moriquchi 等將高密度的豬滑膜間充質干細胞在抗壞血酸的培養液中，通過懸浮培養構建了細胞三維支架(TEC)，將MSC 植入TEC 再固定在半月板缺損處，6 個月后材料整合到相鄰半月板內。證實SMSC 衍生的TEC 可以成為一種修復半月板缺損的再生載體材料。另外，有研究證實，源于滑膜的成纖維細胞能通過遷移增殖和分化對半月板修復進行調節。

在骨關節炎(OA)和類風濕關節炎(RA)模型中，Ryu 等將SMSC 于硝普鈉刺激的軟骨細胞(RA 或OA模型)共培養，發現共培養后能促進軟骨細胞的生長，此外共培養后細胞能產生胰島素生長因子(IGF-1)，抑制炎性因子(NO、IL -6、CCL2/MCP -1 和CCL3/MIP-1α)的產生。在肌腱、韌帶的修復領域，SMSC 較其他MSC 在肌腱纖維分化的能力上有明顯優勢。

七、展 望

盡管在SMSC 的體外增殖、多向分化潛能、免疫特性等方面已有了廣泛的研究，但目前還有許多尚未解決的問題，未能篩選出SMSC 表面特異性的標志分子。對于SMSC 的鑒定缺乏公認統一的標準，軟骨分化的相關研究多局限于體外試驗和動物試驗，仍存在很多不足，如未找到理想的SMSC 支架材料、種植材料的過度增殖和血管翳形成等等問題尚需要完善。此外，由于MSC 體外培養后具有免疫抑制效應，可能存在潛在的激發惡性腫瘤的風險，也給再生組織工程提出了更深層次的難題。

由于SMSC 具有明顯的可塑性、容易獲取、體外增殖能力強、來源不受患者年齡限制以及免疫調節、免疫原性弱等諸多優點，被視為一種很有前景的種子細胞和生物治療藥物。因此，SMSC 已取代BMSC 成為軟骨組織工程最有潛力的種子細胞，改進細胞三維支架，改進誘導方法，提高細胞誘導效率，誘導出接近人體正常軟骨的組織工程軟骨是目前研究的重要任務之一。

1 Sakaquchi Y，Sekiya I，Yagishita K，et al. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues:superiority of synovium as a cell source［J］. Arthritis Rheum，2005，52:2521 -2529

2 Santhaqunam A，Dos Santos F，Madeira C，et al. Isolation and ex vivo expansion of synovial mesenchymal stromal cells for cartilage repair［J］. Cytotherapy，2014，16(4):440 -453

3 Edwards JC. The nature and origins of synovium:experimental approaches to the study of synoviocyte differentiation［J］. J Anat，1994，184:493 -501

4 KurthTB，Dell'accioF，CrouchV，et al. Functional mesenchymal stemcell niches in adult mouse knee joint synoviumin vivo［J］. Arthritis Rheum，2011，63:1289 -1300

5 Yoshimura H，Muneta T，Nimura A，et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow，synovium，periosteum，adipose tissue，and muscle［J］. Cell Tissue Res，2007，327(3):449 -462

6 de Bari C，Dell' Accio F，Karystinou A，et al. A biomarker based mathematical model to predict bone-forming potency of human synovial and periosteal mesenchymal stem cells ［J］. Arthritis Rheum，2008，58(2):501 -510

7 張正政，李衛平，楊睿，等.滑膜間充質干細胞分離培養、免疫表型鑒定及在混合淋巴反應體系中的抑制效應［J］. 中國組織工程研究，2012，16(19):3515 -3519

8 Guo K，Ikehara S，Meng X. Mesenchymal stem cells for inducing tolerance in organ transplantation［J］. Front Cell Dev Biol，2014，2:8

9 Rui YF，Du L，Wang Y，et al. Bone morphogenetic protein2 promotes transforming growth factor beta3 induced chondregenesis of human osteoarthritic synovium derived stem cells［J］.Chin Med J:Engl，2010，123(21):3040 -3048

10 Xu T，Wu M，Fang J，et al. Rho A/Rho kinase signaling regulates transforming growth factor-beta1 -induced chondrogenesis and actin organization of synovium-derived mesenchymal stem cells through interaction with the smad pathway［J］. Int J Mol Med，2012，30(5):1119 -1125

11 Kim Y，Ryu JS，Yeo JE，et al. Overexpression of TGF-β1 enhances chondrogenic differentiation and proliferation of human synovium-derived stem cells［J］. Biochem Biophys Res Commun，2014，450(4):1593 -1599

12 Drv H，Jorqenson K，Ando W，et al. Effect of calcium on the proliferation kinetics of synovium-derived mesenchymal stromal cells［J］.Cytotherapy，2013，15(7):805 -819

13 Liu Y，Lu QZ，Pei R，et al. The effect of extracellular calcium and inorganic phosphate on the growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in vitro:implication for bone tissue engineering［J］. Biomed Mater，2009，4:25004

14 Milosevic J，Juch F，Storch A，et al. Low extracellular calcium is sufficient for survival and proliferation of murine mesencephalic neural precursor cells［J］. Cell Tissue Res，2006，324:377e84

15 Eklou-Kalonji E，Denis I，Lieberherr M，et al. Effects of extracellular calcium on the proliferation and differentiation of porcine osteoblasts in vitro［J］. Cell Tissue Res，1998，292:163e71

16 Lin T，Tsai JL，Lin SD，et al. Accelerated growth and prolonged lifespan of adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells in a medium using reduced calcium and antioxidants［J］. Stem Cells Dev，2005，14:92e102

17 邵博，龔忠誠，劉慧，等.軟骨細胞上清液誘導滑膜間充質干細胞微團培養成軟骨［J］.中國組織工程研究，2014，18(1):100 -105

18 Pei M，He F，Boyce BM，et al. Repair of full - thickness femoral condylecartilage defects using allogeneic synovial cell-engineered tissueconstructs［J］. Osteoarthritis Cartilage，2009，17:714 -722

19 Chang CH，Chen CC，Liao CH，et al. Human acellular cartilage matrix powders as a biological scaffold for cartilage tissue engineering with synovium-derived mesenchymal stem cells［J］. J Biomed Mater Res A，2014，102(7):2248 -2257

20 Pei M，He F，Li J，et al. Repair of large animal partial -thickness cartilage defects through intraarticular injection of matrix-rejuvenated synovium-derived stem cells［J］.Tissue Eng Part A，2013，19(9 -10):1144 -1154

21 Lee JC，Min HJ，Park HJ，et al. Synovial membrane-derived mesenchymal stem cells supported by platelet-rich plasma can repair osteochondral defects in a rabbit model［J］. Arthroscopy，2013，29(6):1034 -1046

22 Lee JK，Lee S，Han SA，et al.The effect of platelet-rich plasma on the differentiation of synovium-derived mesenchymal stem cells［J］.J Orthop Res，2014，32(10):1317 -1325

23 Elder S，Thomason J.Effect of platelet -rich plasma on chondrogenic differentiation in three - dimensional culture［J］. Open Orthop J，2014，8:78 -84

24 Lee JC，Lee SY，Min HJ，et al. Synovium - derived mesenchymal stem cells encapsulated in a novel injectable gel can repair osteochondral defects in a rabbit model［J］. Tissue Eng Part A，2012，18(19 -20):2173 -2186

25 Wakitani S，Takaoka K，Hattori T，et al. Embryonic stem cells injected into the mouse knee joint form teratomas and subsequently destroy the joint［J］. Rheumatology:Oxford，2003，42(1):162 -165