山柰酚通過上調HO－1抑制LPS誘導血管內皮細胞HMGB1表達的實驗研究＊

牟界 王杰 張文斌 雷文匯

（重慶市中醫院呼吸內科，重慶 400011）

致炎因子和炎癥介質導致的血管內皮細胞（endothelium）損傷是膿毒血癥（sepsis）、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）以及冠狀動脈硬化性心臟病（coronary arteriosclerotic heart disease，CAD）等炎癥性疾病共同的病理生理特征［1－5］。目前認為，改善和減輕血管內皮細胞損傷是治療膿毒血癥、ARDS 和CAD 等炎癥性疾病的關鍵［6，7］。山柰酚（kaempferol）屬于黃酮 類化合物（flavonoid），在包括綠茶、西蘭花和藏紅花等多種植物中廣泛存在［8－11］。目前研究發現山柰酚具有抑制炎癥反應、抑制氧化應激、抑制細菌病毒生長、調節腫瘤增殖和侵襲以及調節糖代謝等廣泛的藥理作用［8－11］。同時Kim TH 等的研究發現山柰酚抑制炎癥反應的機制與抑制高遷移率族蛋白1（High mobility group box－1protein，HMGB1）密切相關，但具體的分子機制并不明確［12］。本研究旨在探討山柰酚對脂多糖（LPS）誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）炎癥反應的影響及其潛在分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 TRIzol試劑和qPCR 試劑盒購自寶生物工程有限公司；鼠抗人HO－1抗體、鼠抗人HMGB1抗體和鼠抗人β－actin抗體均購于美國Santa Cruz公司；山柰酚購于美國Sigma公司，DMEM 培養基購于美國Gibco公司，小牛血清購于杭州四季清，其余試劑均為分析純。

1.2 細胞培養 人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）常規接種在含10%胎牛血清、100g／L 青霉素、100g／L 鏈霉素的RPMI 1640 培養液中，置于37℃、95%空氣、5%CO2孵箱內培養。每48h換液、傳代2次，取對數生長期細胞用于實驗。人臍靜脈內皮細胞分為對照組（Control組）、LPS組和LPS＋山柰酚（LPS＋KF組）。其中對照組細胞加入PBS；LPS組和LPS＋KF組加入終濃度為1μg／ml的LPS；LPS＋KF組加入終濃度為80μM 的山柰酚溶液進行干預［13］。

1.3 細 胞HMGB1 和HO－1 mRNA 表達檢測qPCR 法檢測HMGB1和HO－1mRNA 表達水平，按照試劑盒說明書提取細胞的總RNA 并合成cDNA。然后進行熒光定量PCR 擴增，反應體系為25μl，使用β－actin作為內參照。引物序列如下：HMGB1正義5′－TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA－3′，反 義5′－GCATT AGCTTCAGAT TTACGGGT－3′；HO－1 正義5′－GGCTG ACAAGG CTCGTTATG－3′，反義5′－GGGC GGTACTCAGAA CAGAAC－3′；β－actin：正義：5′－CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT－3′，反義：5′－ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA－3′。使用2－ΔΔCt法對MCP－1和HMGB1 mRNA 表達水平進行測定，ΔΔCt ＝（Ct，目標－Ct，β－actin）干預組－（Ct，目標－Ct，β－actin）對照組。

1.4 Western blotting 法檢測細胞中HMGB1 和HO－1蛋白表達水平 干預24h后，按照試劑盒操作要求，首先提取HUVECs細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人抗體HMGB1（1∶900）、HO－1（1∶800）和β－actin（1∶1500），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1000），用ECL 進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.5 統計學方法 計量資料以均數±標準差表示。采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，兩樣本均數多重比較采用LSD 法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HMGB1 mRNA 和蛋白的表達 干預24h 后，使用qPCR 法和western blot法對人臍靜脈內皮細胞HMGB1mRNA 和蛋白的表達水平進行檢測。與對照組相比較，在LPS 干預后人臍靜脈內皮細胞HMGB1mRNA 和蛋白的表達水平明顯增加，差異均有顯著統計學意義（P 均＜0.05）。但LPS組較LPS＋山柰酚組HMGB1mRNA 和蛋白的表達增加更加明顯，差異均有顯著統計學意義（P 均＜0.05），見表1和圖1。

表1 人臍靜脈內皮細胞HO－1和HMGB1mRNA和蛋白表達水平（n＝5，）Table 1 The mRNA and protein expression of HO－1and HMGB1in HUVECs

表1 人臍靜脈內皮細胞HO－1和HMGB1mRNA和蛋白表達水平（n＝5，）Table 1 The mRNA and protein expression of HO－1and HMGB1in HUVECs

注：①與對照組相比較P＜0.05；②與LPS組相比較P＜0.05。

圖1 人臍靜脈內皮細胞HMGB1蛋白表達的western blot結果Figure 1 The western blot results of HMGB1protein expression in HUVECs

圖2 人臍靜脈內皮細胞HO－1蛋白表達的western blot結果Figure 2 The western blot results of HO－1protein expression in HUVECs

2.2 HO－1mRNA 和蛋白的表達 表1和圖2可知，干預24h后，使用qPCR 法和western blot法對人臍靜脈內皮細胞HO－1mRNA 和蛋白的表達水平進行檢測。與對照組相比較，在LPS干預后人臍靜脈內皮細胞HO－1mRNA 和蛋白的表達水平明顯降低，差異均有顯著統計學意義（P 均＜0.05）。但LPS 組較LPS＋山柰酚組HO－1 mRNA 和蛋白的表達下降更加明顯，差異均有顯著統計學意義（P 均＜0.05）。

3 討論

血管內皮細胞（endothelium）主要是指內襯于血管最內側的單層扁平上皮細胞。研究發現血管內皮細胞不僅僅具有維持血管壁結構完整性的作用，還廣泛參與了凝血與抗凝調節、免疫炎癥調節、組織再生、血壓以及內分泌調節等多種生理和病理過程［4－7，14］。目前認為血管內皮細胞是膿毒血癥、ARDS以及動脈粥樣硬化等炎癥性疾病的主要損傷部位［4－7，14］。同時，大量研究證實抑制和減輕炎癥因子導致的血管內皮細胞損傷對于改善膿毒血癥、ARDS以及動脈粥樣硬化等炎癥性疾 病均具有 積極作用［4－7，14－18］。Lee W等研究證實穿心蓮內酯可以通過抑制HMGB1 表達對膿毒血癥狀態下的小鼠具有保護作用，并認為與改善血管內皮細胞損傷密切相關［15］。何健卓等的研究發現血必凈注射液可以通過調節血管內皮細胞功能改善膿毒血癥患者的微循環狀態和血流動力學異常［16］。Qin M 等研究顯示楊梅樹皮苷可以通過PI3K／Akt信號通路減輕ox－LDL 誘導的血管內皮細胞凋亡對動脈粥樣硬化產生保護作用［17］。Zhang Y等的研究發現miR－26a可以通過調節TRPC6表達改善ox－LDL誘導的血管內皮細胞凋亡［18］。以上實驗表明血管內皮細胞的功能狀態在膿毒血癥和動脈粥樣硬化等炎癥性疾病的發生和發展過程中扮演著重要的角色，減輕和改善血管內皮細胞的損傷對于治療炎癥性疾病具有積極的意義和價值。

山柰酚（kaempferol）屬于黃酮類化合物（flavonoid），在多種蔬菜和水果中均發現山柰酚的存在。目前大量的研究表明山柰酚及其衍生化合物具有抑制炎癥反應、抑制氧化應激、抑制細菌和病毒生長、調節腫瘤增殖和侵襲以及調節糖代謝等廣泛的藥理作用［8－12，19，20］。Yang QS等的研究發現山柰酚可以通過抑制TNF－α和IL－6等炎癥介質的表達和過度的氧化應激反應對失血性休克小鼠多個器官產生保護作用［11］。同時，Chung MJ等的研究發現山柰酚及其衍生物對于卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的氣道炎癥反應有顯著的抑制作用［19］。Tang XL 等的研究證實山柰酚可以有效抑制LPS和ATP誘導的心肌成纖維細胞炎癥反應［20］。進一步Kim TH 等的研究發現山柰酚抑制炎癥反應的機制與下調高遷移率族蛋白1（High mobility group box－1protein，HMGB1）密切相關，但具體的分子機制仍不明確。

血紅素氧化酶－1（heme oxygenase－1，HO－1）又稱為熱休克蛋白32（heat shock protein 32），其分子量為32kD，屬 于熱休克蛋白家族成員之一［21，22］。HO－1廣泛存在于細胞的微粒體中，主要參與自由鐵、一氧化碳和膽綠素等的代謝過程。目前研究發現HO－1同時還參與了炎癥反應和氧化應激反應的調控［21，22］。在炎癥狀態下上調HO－1 的合成與表達對于改善細胞和器官功能有積極作用［21，22］。近期研究表明HO－1 是HMGB1重要的調節因素［21，22］。Li Y等的研究發現在小鼠ARDS模型中氫氣可以通過上調HO－1的合成抑制HMGB1 的表達改善肺組織的炎癥反應，并改善模型動物的死亡率［21］。Kim YM 等的研究也證實在巨噬細胞系RAW264.7細胞中甘草皂苷可以通過上調HO－1 的合成抑制LPS 誘導的HMGB1的表達［22］。本實驗結果表明在人臍靜脈內皮細胞中山柰酚可能可以通過上調HO－1的合成抑制LPS誘導的HMGB1的表達。

4 結論

山柰酚可能可以通過上調HO－1抑制LPS誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）HMGB1的表達，提示山柰酚對炎癥狀態下的血管內皮細胞具有保護作用。本研究為山柰酚應用于膿毒血癥和ARDS等炎性疾病的治療奠定了一定的基礎。

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