蛋白質相互作用研究技術的新進展

郭 睿綜述，劉全忠審校

（天津醫科大學總醫院皮膚性病科，天津300052）

綜述

蛋白質相互作用研究技術的新進展

郭 睿綜述，劉全忠審校

（天津醫科大學總醫院皮膚性病科，天津300052）

蛋白質相互作用；酵母雙雜交系統；串聯親和純化；噬菌體展示；免疫共沉淀；GST-Pull down；Far-Western blotting；熒光共振能量轉移；生物信息學

蛋白質相互作用網絡基于蛋白質的生物學原理，它們之間的相互作用決定了分子與細胞水平上作用機制，從而起到調控機體健康和疾病狀態的作用。此作用網絡對于復雜的多基因疾病的靶向治療領域的研究具有深遠的意義[1]。本文著眼于酵母雙雜交系統、串聯親和純化、噬菌體展示、免疫共沉淀、GST-Pull down、Far-Western blotting、熒光共振能量轉移、生物信息學等蛋白質相互作用研究方法，對其進行比較分析并進行綜述。

1 生物化學與分子生物學研究技術

1.1 酵母雙雜交系統

1.1.1 原理 Fields和Song[2]首次在研究真核基因轉錄調控時建立該系統。其理論基礎是基于GAL4轉錄激活因子的特性。GAL4轉錄激活因子是一種由兩個彼此分離但功能必需的結構域組合而成，即DNA結合結構域（DNA-BD）和轉錄激活結構域（AD）。二者在臨近位置相互作用時可重建功能性轉錄因子。在MATCHMAKER酵母雙雜交系統（Y2H）中，誘餌蛋白表達融合到GAL4的DNA-BD，而獵物蛋白表達融合到GAL4 DNA-AD。當誘餌和獵物蛋白相互作用時，DNA-BD與AD形成功能性轉錄因子，導致酵母報告基因表達的激活，通過檢測報告基因的表達產物可判斷兩種蛋白是否發生相互作用。此方法可以用來確定新的蛋白質的相互作用，分析兩種已知蛋白的相互作用以及相互作用的蛋白質結構域分析[3-4]。

1.1.2 優缺點 酵母雙雜交技術可以精確地分析已知蛋白間的相互作用，篩選編碼未知蛋白的基因，具有真實性、敏感性、高效性、廣泛性等特性。其自身也存在缺點，如易產生假陽性、假陰性等[5]。

1.1.3 應用 You等[6]將wt-APP695與pBT3-SUC誘餌載體相結合形成pBT3-SUC-APP復合物，利用酵母雙雜交篩選系統和免疫共沉淀技術，證實在阿爾茨海默癥中，Staufen 1蛋白（STAU1）可與淀粉樣前體蛋白（APP）作用，由于Stau1屬于雙鏈RNA結合蛋白家族，在哺乳動物系統介導mRNA的降解，因此推測淀粉樣前體蛋白也可能參與mRNA調控。

1.2 串聯親和純化

1.2.1 原理 串聯親和純化理論基礎[7]是一個利用兩個親和標簽不同時序來純化蛋白組件。TAP標簽蛋白由Protein A、TEV蛋白酶可剪切序列和鈣調蛋白結合肽（CBP）組成[8]。在第一步純化步驟中，TAP標記的蛋白復合物通過第一個標簽Protein A特異性結合到IgG瓊脂珠。此TAP標簽標記的蛋白質成分可被TEV蛋白酶裂解。清洗之后用洗脫液（含TEV蛋白酶）分離Protein A標簽使含有靶蛋白的復合物釋放。第二步親和步驟，該蛋白質復合物通過第二個標簽CBP固定于鈣調蛋白瓊脂珠。CBP-鈣調蛋白相互作用具有鈣依賴性，而鈣離子螯合劑用于第二步洗脫步驟來釋放最后的蛋白復合物。此分離純化的蛋白可通過串聯質譜、免疫雜交等方法進行鑒定分析。TAP-MS法已被證明在細菌、酵母和哺乳動物細胞以及多細胞生物如線蟲、果蠅和老鼠的蛋白質相互作用研究中均有效[9]。

1.2.2 優缺點 TAP技術假陽性和假陰性水平低，與質譜等其他技術聯用可大規模地研究細胞內蛋白質分子之間的相互作用網絡。但TAP技術具有一定局限性：TAP標簽的引入可能會影響靶蛋白和親和柱的結合；少數靶蛋白可能會在TEV蛋白酶處理過程中被破壞；細胞裂解過程有時會影響TAP標簽表達[10]。

1.2.3 應用 Campden[11]應用TAP技術和質譜分析技術在胞核和細胞裂解物中來確定結合Gβ1亞基的候選蛋白，證實異三聚體蛋白Gβγ亞基調節細胞活性的作用。

1.3 噬菌體展示 噬菌體展示技術是將外源性（多）肽表達在噬菌體顆粒表面上，再利用其配體的特異性親和力將有需要的蛋白質或多肽篩選出來的技術。一個文庫的噬菌體顆粒可表達多種多樣的肽，用來選擇那些結合了所需的目標。噬菌體展示技術已被應用在蛋白質-蛋白質相互作用的抗原表位分析。特定的配體分離噬菌體庫可以用于治療目標驗證、設計藥物和疫苗的開發。噬菌體展示技術也可以和其他方法結合使用[12]。噬菌體展示技術難點在于是如何根據不同研究目標和目的基因特征來采用相應的噬菌體，選擇相應展示位點和錨定蛋白以及選擇設計定位展示在噬菌體表面錨定蛋白的N端或是C端等，隨著遺傳學和基因工程學的發展，噬菌體展示技術會慢慢攻克其難點[13-14]。

1.4 免疫共沉淀 免疫共沉淀是確定新蛋白間相互作用或確定已知蛋白質形成的復合物的最廣泛使用的方法之一。原理是利用抗原抗體特異性結合以及細菌的Protein A或G特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的現象。操作方法是將目標蛋白與帶標簽蛋白的特異性抗體結合。抗體結合蛋白以及任何結合到目標蛋白的蛋白都可以用樹脂沉淀，未結合到目標蛋白的蛋白可被洗滌樣品洗脫。由此產生免疫復合物，然后通過免疫印跡分析，以研究蛋白質-蛋白質相互作用[15]。此方法不適用于大規模篩查相互作用蛋白，但其優勢在于能確定在生理條件下細胞或組織內是否存在與目的蛋白能夠相結合并作用的蛋白質[16]。

1.5 GST-Pull down

1.5.1 原理 使用GST融合蛋白的下拉技術或親和沉淀測定法已成為最常見用來測定興趣蛋白（誘餌蛋白）是否結合新蛋白質的方法之一。目的蛋白溶液過柱后，獵物蛋白會結合于瓊脂珠或GST本身，洗脫結合物后通過SDS-PAGE電泳分析[17]。

1.5.2 優缺點 GST-pull down是在體外直接驗證蛋白質-蛋白質相互作用的最常見的方式，能驗證與已知融合蛋白質相互作用的未知蛋白并且能驗證兩已知蛋白質之間是否存在相互作用。該方法特異性較強，能減少一定的假陽性率[18]。但該方法不適用于大規模篩查相互作用的蛋白，除此之外，活性融合蛋白的量及避免內源性誘餌蛋白干擾是該方法成功的關鍵[16]。

1.5.3 應用 Rab5蛋白是所有的真核細胞早期內涵體融合和內吞作用的主要調節器。Qi等[19]進行Rab5活性測定，采用GST融合蛋白結合Rab5效應器如Rabaptin-5或Rabenosyn-5，證實EEA1特異結合GTP結合的Rab5。

1.6 Far-Western blotting Far-Western Blotting是研究蛋白質-蛋白質相互作用的一種簡便方法，是將目標蛋白（獵物蛋白）固定在膜上，然后用非抗體蛋白（誘餌蛋白）檢測。此方法檢測蛋白質基于蛋白質探針結合位點的存在或缺失。當特定的模塊化蛋白結合結構域作為探針時，這種方法可以用來研究蛋白質間相互作用，如參與信號轉導的生物過程特性，包括翻譯后修飾調節作用[20]。

1.7 蛋白質芯片 蛋白質芯片是指將蛋白質或多肽等固定于支持介質表面，用于樣品成分和蛋白質之間相互作用的分析[21]，具有高通量、高信噪比等特點，可有效減少藥物研發周期并提高醫療診斷效率。目前存在的問題是如何高通量地制造純化高親和性的探針[22]。

1.8 雙分子熒光互補 原理是將熒光蛋白在特定的位點切開，形成不發熒光的N和C端2個多肽，2個片段在細胞內共表達或體外混合時，不能自發組裝成完整的熒光蛋白。但是，當這2個熒光片段分別融合到一組有相互作用的目標蛋白上，由于目標蛋白質的相互作用重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，受到激發后發射出特定波長熒光，可以快速、直觀地檢測目標蛋白是否具有相互作用[23-24]。

2 生物物理學研究技術

2.1 熒光共振能量轉移 熒光共振能量轉移原理是兩種蛋白質（bait蛋白，prey蛋白）分別綴合有供體和受體熒光團，當它們彼此相互作用，且距離比100 ?（10 nm）更接近時，則可誘導FRET信號[25]。FRET結合顯微鏡使用，具有高時間和空間分辨率，可檢測特定的亞細胞組分來研究蛋白相互作用的動力學。FRET顯微鏡技術已成為檢測體內兩蛋白直接結合的相互作用的有力手段[26-27]。

2.2 表面等離子共振分析 當入射光的光子撞擊金屬表面時發生表面等離子體共振（SPR）。在一定入射角時，部分光能可通過金屬涂層與金屬表面層的電子相耦合，從而達到激發態，這種電子運動被稱為等離子體。在SPR生物傳感器中，探針首先被固定到傳感器表面。當目標分子的溶液流入并與該表面相接觸，探針-靶點通過親和相互作用相結合時，會引起SPR傳感器表面折射率的增加，導致共振角的改變，通過軟件檢測處理這些信號從而得到最終分析結果。該技術具有測量靈敏度高，無需標簽修飾，實時高效測定相互作用等特點[28]。利用SPR生物傳感器等研究可以應用于如下方面：（1）SPR對特定的生物樣本的最有效的親和分離所需的固定化條件的選擇。（2）SPR結合質譜法進行蛋白質鑒定。（3）基于SPR的固定化配體蛋白的鑒定以及相互作用的驗證[29]。

2.3 其他 原子作用力顯微技術、等溫滴定熱分析技術、核磁共振譜分析技術、熒光偏振實驗技術等相關技術各具其特性，豐富了生物物理學在分析蛋白相互作用中的方法。

3 生物信息學研究技術

蛋白質之間要發生相互作用必須要有相應的結構基礎，包括接觸面的互補性、結合特異性和親和力等[30]。生物信息學技術，包括蛋白質結構數據和結構預測等方法可以來預測蛋白質相互作用。主要方法有同源建模、多體串線法和計算機模擬分子對接等。

4 展望

蛋白質相互作用及作用網絡已成為越來越熱門的課題。目前各種研究方法均有優勢與不足。相信通過對現有技術的改進、不同技術的結合以及新技術的創新，將會使蛋白質相互作用研究越來越豐富、準確。

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（2015-08-05收稿）

Q7

A

1006－8147（2015）06-0542-03

郭睿(1991-)，男，博士在讀，研究方向：皮膚性病學;通信作者：劉全忠，E-mail:liuquanzhong@medmail.com.cn。