Smurf2對肝纖維化中TGF-β/Smad通路的影響

駱菁怡,張立婷,魯明霞,顏小明(綜述),肖　萍(審校)

(　1.漢中職業技術學院醫學系，陜西 漢中 723000； 2.蘭州大學第一醫院東崗分院肝病科，蘭州 730000；

3.蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000； 4. 蘭州大學第一醫院傳染病研究室，蘭州 730000)

Smurf2對肝纖維化中TGF-β/Smad通路的影響

駱菁怡1※,張立婷2,魯明霞2,顏小明3△(綜述),肖萍4(審校)

(1.漢中職業技術學院醫學系，陜西 漢中 723000； 2.蘭州大學第一醫院東崗分院肝病科，蘭州 730000；

3.蘭州大學第一臨床醫學院，蘭州 730000； 4. 蘭州大學第一醫院傳染病研究室，蘭州 730000)

摘要：轉化生長因子β1(TGF-β1)在肝纖維化的發生、發展中起重要作用，它作為TGF-β1/Smad信號通路的起始因子激活下游信號，使處于非活性狀態下的肝星狀細胞分化為肌成纖維細胞，促進并維持了肝纖維化的發生。泛素化是體內蛋白質翻譯后修飾并降解的重要途徑之一，泛素-蛋白酶體途徑中的泛素連接酶Smurf2通過多種途徑抑制TGF-β1/Smad通路表達。Smurf2作為一種抗肝纖維化發生的酶受到廣泛關注，但機制并未深入系統地被闡述。

關鍵詞：肝纖維化；轉化生長因子β1/Smad；泛素；Smurf2；肝星形細胞

肝病是我國的高發病之一，肝纖維化是指各種由慢性疾病引起的肝臟持續創傷修復反應，從而導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度沉積和肝臟功能受損的病變[1]。肝纖維化是各種損傷引發慢性肝病、肝硬化及肝癌的共同病理基礎和必經階段[2]，肝星形細胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化、增殖是其發生的關鍵細胞學基礎[3]。肝臟可能在持續的肝細胞破壞和再生下發展為廣泛的正常肝細胞結構異常，進而發展為肝纖維化，所以控制肝纖維化產生是防止肝硬化發生的重要關口，但現今還沒有有效的抗纖維化治療，所以研究肝纖維化產生的機制顯得尤為重要。主要導致肝纖維化的細胞是HSC，在成人的肝臟中，未活化的HSC位于肝細胞和肝竇內皮細胞之間，當肝臟受到損傷，HSC被激活，分化為肌成纖維細胞，并增殖擴散，產生主要成分為膠原的ECM。急性損傷后，活化的HSC可促進肝細胞增殖和器官修復，但在慢性損傷中，過多的ECM打亂了正常的肝細胞結構，導致肝纖維化和肝硬化[4]。現就Smurf2對肝纖維化中轉化生長因子(transforming growth factor-beta,TGF-β)1/Smad通路的影響進行綜述。

1肝纖維化發生的機制

1.1TGF-β1/Smad信號通路

1.1.1TGF-βTGF-β是一類由結構、功能相關的多肽生長因子亞家族組成，具有旁分泌、自分泌作用的超家族，包括至少25種相關蛋白，其中TGF-β1占主要部分。TGF-β1在多種細胞反應中扮演主要角色，起著細胞增殖、凋亡、分化、遷移、附著、血管形成、刺激ECM產生和促使ECM降解等廣泛的生物學作用[5]。目前認為，TGF-β1在促進HSC分泌膠原中發揮重要作用，是致纖維化最主要的細胞因子[6]。TGF-β1以無活性的形式被分泌，但在應激狀態下，潛在的TGF-β1復合物被組織-傷害特定機制激活而發揮生物學效應。在肝臟中，TGF-β1可由多種細胞分泌產生，包括實質細胞及間質細胞，如庫普弗細胞、內皮細胞、肝細胞、HSC等。在肝纖維化的發展過程中，TGF-β可激活纖維化細胞因子和促使肝星狀細胞分化為肌纖維細胞，持久的TGF-β刺激可導致ECM堆積和金屬蛋白酶組織抑制劑的合成，激發肝纖維化產生[5，7]。

1.1.2TGF-β受體(TGF-beta receptors,TβR)TGF-β1和TβR在活體組織中廣泛表達，TGF-β1與靶細胞表面相應的TβR結合后激發下游信號產生。TβR有3種(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)，其結構相似，分為膜外區、跨膜區、膜內區，其中Ⅰ型和Ⅱ型為信號傳遞受體，跨膜區內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域具有細胞信號轉導所必需的絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶活性，與受體后細胞內信號轉導有關[8]；Ⅰ型受體的胞質近膜區含有高度保守的絲氨酸和甘氨酸結構域，是受體激酶活性的作用區域；3種類型的TβR膜外區均富含半胱氨酸。

1.1.3Smad的分類及功能Smad為TGF-β超家族特異性受體后信使蛋白分子，通過介導TGF-β信號從細胞膜傳入細胞核而發揮中介功能。目前發現有8種Smads蛋白，根據各自在信號轉導中的功能不同將其分為3類：①受體Smad(R-Smad)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，這一類Smad是TGF-β受體復合物下游作用的靶分子，可被活化的TβRⅠ識別，其中Smad2和Smad3與TβRⅠ結合，形成轉錄復合體，與靶基因的特定部位結合，參與TGF-β信號轉導，R-Smad 的磷酸化狀態決定Smad復合體的入核與出核、結合與分離，因此在TGF-β信號通路中是最關鍵的因子[9]。②協同Smad(Co-Smad)，主要是Smad 4。R-Smad與Smad4結合后形成異源復合物，能進入細胞核調節轉錄，所以Smad4是TGF-β信號轉導必需的中間分子。③抑制型Smad(I-Smad)，包括Smad6和Smad7。Smad7與TβRⅠ的緊密結合產生競爭性拮抗占據作用，占據了Smad2、Smad3與活化型TβRⅠ的結合位點從而阻斷依賴TGF-β1的Smad2/Smad4復合物的形成，從而對TGF-β1信號轉導通路起負調控作用[7，10]。

TGF-β/Smad信號通路表達的基本過程為：刺激因子作用于HSC后，處于自動磷酸化狀態的TβRⅡ在TβRⅢ的輔助作用下與TGF-β配體結合后激活跨膜TβR，Smads蛋白被跨膜受體磷酸化，該Smad再與協同Smad即Smad4結合，形成復合物后轉入細胞核內，激活的復合物和兩類DNA結合輔助因子結合，決定靶基因的轉錄活性[11]。Smad復合體進入細胞核后與靶基因啟動子的特異序列結合形成穩定的復合物，間接地對靶基因進行調節。同時，Smad復合體直接與細胞核內DNA結合進而直接激活目的基因的轉錄。HSC活化后分泌大量ECM沉積在肝細胞間，同時活化后的HSC可自分泌TGF-β1而形成級聯環狀放大反應促使纖維化發生。

1.2非TGF-β1/Smad信號轉導路徑促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/Akt及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路等可直接由TGF-β介導，也可間接參與調節TGF-β1/Smad通路的信號轉導。Smad信號轉導與非Smad信號轉導間存在廣泛聯系，并對Smad信號轉導通路進行調節。在一些細胞中非Smad信號通路尤為重要，但TGF-β/Smad信號通路是目前公認的致纖維化的主要通路。

2以TGF-β/Smad通路為靶點的抗纖維化治療

研究發現，TGF-β通路在肝纖維化產生與發展中起重要作用，因此干擾其信號轉導成為抗纖維化研究的重要方向。研究主要集中在如何抑制TGF-β本身、干擾受體與配體結合及抑制其活性、對TGF-β下游信號的負性調節[12]。

2.1針對TGF-β抑制肝纖維化產生通過抑制TGF-β的產生可在理論上降低肝纖維化的發生。有研究證實，腎素-血管緊張素系統可促進TGF-β的分泌合成，應用血管緊張素轉換酶抑制劑及血管緊張素受體阻斷劑后，實驗大鼠纖維化肝臟中TGF-β mRNA表達下降，TGF-β蛋白明顯減少[12]。體外實驗證實重組肝細胞生長因子也可阻斷TGF-β mRNA表達。另外，TGF-β產生后阻斷其激活也具有抗纖維化的重要意義，肝細胞中存在多種TGF-β前肽復合物激活因子，通過干擾激活因子與相關肽的作用可以阻止肝臟損傷及肝纖維化形成。

2.2作用于TGF-β受體TGF-β的生物信號通過TβRⅠ和TβRⅡ傳遞，通過阻斷TGF-β與其受體的結合是防治肝纖維化的有效途徑之一，或通過競爭性結合活性受體阻斷信號轉導。Ueno等[13]構建了融合人IgG的TβRⅡ外功能區的腺病毒載體，在纖維化大鼠中應用可溶性TβRⅡ，使其與胞膜TβRⅡ 競爭性結合，可降低HSC的激活和增殖，抑制了TGF-β通路信號的傳遞。

2.3針對TGF-β下游信號轉導Smads蛋白分子是TGF-β唯一的受體后蛋白，通過抑制Smads蛋白分子的生成、磷酸化和核轉位可抑制肝纖維化的發生[14]。Dooley等[15]向大鼠注射攜帶有Smad7 cDNA的腺病毒載體后發現，Smad7高表達的大鼠膠原含量降低從而HSC激活受到抑制。也有體外報道Smad7通過抑制Smad2/3磷酸化及活化的Smad復合物核轉位，對已經形成的肝纖維化也有影響。降低組織中Smad3、Smad4的含量或使其活性降低，也能抑制肝纖維化的發生、發展。

因此，TGF-β家族對肝纖維化既有正調控作用，又有負調控作用，所以在阻斷TGF-β通路從而抑制肝纖維化發生時，不能將所有的TGF-β作用都阻斷。因此從理論上推測，針對TGF-β下游信號轉導的阻斷將更具有特異性。由于Smads是TGF-β信號通路中關鍵調節因子，因此改變Smads蛋白水平可影響信號轉導及轉導產物形成。Smad泛素化調節因子2(Smurf2)可通過多種途徑抑制TGF-β下游信號轉導而引起廣泛關注。

3泛素-蛋白水解酶復合體通路及Smurf2對肝纖維化的影響

泛素-蛋白水解酶復合體通路(ubiquition-proteasomepathway,UPP)是真核細胞內高度保守且具有高度選擇性，依賴三磷酸腺苷的重要蛋白質降解途徑。細胞內80%～90%的蛋白質通過UPP降解，其在抗原呈遞、細胞分化、凋亡、蛋白質的翻譯和轉錄中發揮著非常重要的作用[16]。多項研究表明，其異常表達與器官囊性纖維化、腫瘤、神經性病變及肝臟疾病等關系密切。2004年諾貝爾化學獎授予了在“泛素介導的蛋白質降解過程研究”中做出貢獻的三位來自以色列和美國的科學家，以表彰他們發現了UPP。

UPP是由泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素-蛋白結合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2)、泛素-蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligases,E3)、泛素(ubiquitin,Ub)及26S蛋白酶體和泛素解離酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)組成，通過兩個相對獨立的過程對靶蛋白進行降解：靶蛋白泛素化修飾；多聚泛素化修飾的靶蛋白被26S蛋白水解酶復合體識別，降解。E1的半胱氨酸殘基泛素與C端甘氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而獲得活性，泛素在ATP的作用下被E1催化；E1-泛素結合體再將有活性的泛素轉移給E2，形成E2-泛素結合體；E3直接或間接與底物結合后，促使泛素從E2轉移到靶蛋白的賴氨酸殘基上，形成異肽鍵[17]。當一個泛素分子與靶蛋白形成異肽鍵后，其他一些泛素分子通過E3的催化，與底物相連的泛素分子第48位賴氨酸殘基相連，形成一條多聚泛素鏈而完成泛素化，后被蛋白酶體降解。人體中蛋白酶體在細胞核與細胞質內發揮生物效應，主要是26S蛋白酶體。26S蛋白酶體由20S和19S復合體組成，26S蛋白酶體將被泛素化標記的蛋白包裹，20S催化中心將其分解成多個氨基酸殘基的小肽，同時，泛素分子從底物上水解下來，進入下一輪泛素化重復利用。

E3為具有特異性識別功能的泛素蛋白連接酶，在泛素化過程中決定了降解蛋白的特異性。Smurf2是泛素連接酶E3的一種，是C2-WW-人類乳頭狀瘤病毒E6相關性蛋白同源C端(C2-WW-HECT)的同系物[18]，在TGF-β1/Smad信號通路中通過多種途徑介導信號通路轉導，參與肝纖維化的發生、發展。

3.1Smurf2作用于SmadsSmurf2可選擇性作用于R-Smads蛋白，其中Smad 2、Smad 3含有PPXY序列，因此Smurf2可以通過WW結構域與之結合，Smad4因不含脯氨酸-酪氨酸PPXY序列，Smurf2無法直接與Smad4相連，只能通過間接途徑進行調控[19]。研究表明，細胞單獨轉染Smad7基因時不能改變細胞內Smad4水平，單獨轉染Smurf2時只能輕微下調Smad4的表達水平，但如果同時轉染Smad7和Smurf2，Smad4表達明顯下調，Smad7作為中間介質可促使Smurf2泛素化Smad4[20]。此外，Smad 7能夠通過幫助Smurf2募集E2激活連接酶活性，在Smurf2調節TGF-β通路中發揮多重作用。

Smurf2能靶定被激活的Smad 1、Smad2使之降解，促進Smad2降解過程通過Smurf2的E6-AP羧基末端同源結構域催化激活及蛋白水解酶途徑完成。因此，Smurf2的異位表達降低了Smad1、Smad2蛋白表達，但不能減少Smad3的表達。Smurf2的水平在纖維化大鼠肝臟中增高，但在肝硬化大鼠和人類中下降，過度表達的Smurf2使HSC膠原產生減少[21]。

3.2Smurf2作用于TβR人HSC細胞中Smurf2過表達降低了TβRⅠ和Smad7的水平，同時ECM和層粘連蛋白水平下降。在TGF-β的刺激下，Smurf2募集Smad7在細胞核內形成復合物，在TGF-β的刺激下，復合物轉移至細胞質，接下來這一復合物與TβRⅠ相互作用，通過UPP使TβRⅠ表達水平下調，因此阻斷了TGF-β通路的信號傳遞[17]。

Bizet等[22]利用反義RNA下調Smurf2后發現TβRⅠ蛋白水平增高，但在單側輸尿管閉塞模型中發現，Smurf2同時可降解Smad7，最終導致小管間質性纖維病變。

3.3Smurf2與轉錄共抑制因子在肝纖維化中的關系Ski和SnoN是轉錄共抑制因子的核內蛋白，在細胞核內它們通過與TGF-β信號通路中磷酸化的Smad2、Smad3、Smad4復合體結合來抑制其活性，也通過募集轉錄抑制物及阻止轉錄共激活物與Smad2、Smad3、Smad4復合體結合等途徑阻礙TGF-β/Smad通路中靶基因的轉錄[23]。而Ski/SnoN蛋白可被Smurf2泛素化降解，從而間接調節TGF-β信號轉導。研究表明，Smad2可介導Smurf2進入細胞核降解SnoN[23-24]。

Smurf2的表達水平與Ski/SnoN蛋白降解水平同步，即Smurf2表達增強時相應Ski/SnoN蛋白泛素化降解水平增強，相反，當Smurf2表達下降時相應Ski/SnoN蛋白泛素化降解水平減弱[24]。

4小結

Smurf2 mRNA的表達水平隨著TGF-β1的表達增高而增高，因此在肝纖維化發生、發展的早期，用各種方法誘導和提高Smurf2的表達可在一定程度上阻止肝纖維化的進展和肝硬化的發生[25]，但Smurf2也能通過降解轉錄共抑制因子上調TGF-β信號轉導。雖然Smurf2作用于TGF-β通路的各個環節已經被人們的研究揭示，但現今的研究結果仍不能明確究竟是什么原因導致了Smurf2對TGF-β通路的雙向調節、什么情況下Smurf2對TGF-β通路的凈作用是抑制的、在Smurf2調節肝纖維化發生的同時會不會對肝臟產生不良反應，由于并非所有的TGF-β作用都應被阻斷，那么Smurf2在哪個環節調節TGF-β信號轉導能夠在不影響正常生理功能的同時阻止肝纖維化的發生。Smurf2為預防和控制肝纖維化及肝硬化的發生、發展提供了新思路。

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Smurf 2 Impact on TGF-β/Smad Pathway in Liver FibrosisLUOJing-yi1,ZHANGLi-ting2,LUMing-xia2,YANXiao-ming3,XIAOPing4.(1.DepartmentofMedicine,HanzhongVocationalandTechnicalCollege,Hanzhong723000,China; 2.DepartmentofHepatology,theFirstHospitalofLanzhouUniversity,DonggangBranch,Lanzhou730000,China; 3.TheFirstClinicalMedicineCollegeofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China; 4.InstituteofInfection,theFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

Abstract:Transforming growth factor β1(TGF-β1) plays an important role in the development of liver fibrosis,as an initiative factor of TGF-β1/Smad pathway,it could activate downstream signals,which makes the inactive hepatic stellate cells to differentiate into myofibroblasts,promoting and maintaining the state of fibrosis.Ubiquitination is one of the important in vivo ways of translational modifications and protein degradation,and Smurf 2 ubiquitin ligase in ubiquition-proteasome pathway suppresses the expression of TGF-β1/Smad pathway through a variety of ways.Smurf 2 as an anti-hepatic fibrosis enzyme has attracted wide attention,but the mechanisms have not been systematically elaborated.

Key words:Liver fibrosis; Transforming growth factor-β1/Smad; Ubiquitin; Smurf2; Hepatic stellate cells

收稿日期：2014-07-28修回日期：2015-04-02編輯：樓立理

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.016

中圖分類號：R575; R329.2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)17-3113-04