核糖核酸開關用于微生物細胞工廠的智能與精細調控

趙雨佳，張根林，周曉宏，李春

（北京理工大學生命學院生物工程系，北京 100081）

核糖核酸開關用于微生物細胞工廠的智能與精細調控

趙雨佳，張根林，周曉宏，李春

（北京理工大學生命學院生物工程系，北京 100081）

利用代謝工程與合成生物技術對細胞內復雜的代謝網絡和調控網絡進行重構和改造，以建立合成新化合物或提高目標產物產量的微生物細胞工廠是當今綠色化工技術發展的方向之一。微生物代謝途徑的調控受環境和遺傳的雙重影響，細胞通過全局轉錄因子、信使分子和反饋抑制等方式響應環境變化來維持細胞的內穩態；同時細胞還受自身遺傳基因線路的調控，在轉錄、翻譯以及翻譯后修飾過程中調控特定基因的表達。核糖核酸開關是一類調控基因線路表達的RNA元件，通過與金屬離子、糖類衍生物、氨基酸、核酸衍生物以及輔酶等特異性配體結合發生的構象變化，從而啟動或阻斷mRNA的轉錄、翻譯、拼接等過程來調控基因的表達。核糖核酸開關作為天然的生物感受器和效應器通過人工設計可成為微生物細胞工廠智能化和精細化調控的分子工具，并在化工、醫藥、環保、食品等領域得到廣泛應用。

核糖核酸開關；微生物細胞工廠；精細調控；生物轉化；優化；代謝工程；合成生物學

Key words：riboswitch；microbial cell factory；fine regulation；biotransformation；optimization；metabolic engineering；synthetic biology

引 言

微生物由于其種屬多樣性和遺傳多樣性，在38億年的進化歷程中，形成了復雜的代謝途徑，可以生產包括大宗化學品、醫藥、燃料、塑料在內的多種重要的醫藥和化工產品，現已利用谷氨酸棒狀桿菌成功生產絲氨酸[1]、賴氨酸[2]、谷氨酸[3]以及丁二酸[4]等大宗化學品；利用釀酒酵母生產青蒿素[5-6]、紫杉醇[7]、丹參酮[8]等多種名貴藥物；通過藍細菌生產乙醇[9]、正丁醇[10]等生物燃料以及通過大腸桿菌生產聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）[11]、聚羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）[12]等可降解的生物塑料。利用微生物生產化工產品為解決能源危機和環境污染提供了新思路。然而天然的微生物因為產量低或者底物譜窄等原因往往不能滿足工業化生產的需要，因此，需要人為地對其代謝途徑進行改造，通過重組和優化，使微生物細胞內的代謝流和能量流重新分配，成為服務于工業需求的微生物細胞工廠。

利用微生物細胞工廠生產醫藥和化工產品具有清潔、高效、經濟附加值高等優點，已成為發展綠色工業的核心部分。然而長期的研究發現，微生物細胞暴露在環境中會受到來自外界和內部的多種信號刺激，為了維持細胞的內穩態，微生物進化出了復雜的調控網絡來感受信號，進而調控相應的代謝途徑。因此單純的引入外源代謝途徑或者酶往往會導致代謝失衡，不能得到目標產物或者產量難以滿足工業需求。為了得到能滿足工業需求的微生物細胞工廠不僅要對代謝途徑進行改造還要對相應的調控系統進行修飾。但由于其調控的復雜性、人們缺乏在分子水平上對細胞調控機制的了解，難以開發智能的表達調控工具，嚴重制約了微生物細胞工廠的發展。

細胞的調控網絡受環境和遺傳的雙重影響。由于微生物細胞生活在不斷變化的環境中，溫度、pH、營養等環境因素都會對細胞的生理代謝產生影響，細胞通過各種全局轉錄因子以及信使分子感受環境因素的變化從而調控一系列生理過程并通過產物對代謝途徑的反饋抑制等方式使細胞適應環境變化，維持內穩態。同時，細胞可以通過轉錄、翻譯以及翻譯后修飾等方式調控特定基因的表達。核糖核酸開關是細胞內天然存在的表達調控工具，能夠響應單磷酸腺苷環二聚體（c-di-AMP）、單磷酸鳥苷環二聚體（c-di-GMP）等第二信使進而調控微生物細胞產芽孢、維持滲透壓等多種生理過程，還能感受細胞內氨基酸的濃度，在濃度較高時通過使轉錄提前終止或抑制翻譯起始的方式對相應的代謝途徑進行反饋抑制[13-15]，自2002年首次發現就引起了轟動。作為調控基因表達的RNA元件，核糖核酸開關由兩部分組成，適體區（aptamer domain，AD）和基因表達區（expression domain，ED），其中AD能識別特異性的小分子代謝物或金屬離子，與之結合后使ED變構，從而能夠在轉錄水平或翻譯水平上調控相關基因的表達（圖1）[16]。由于核糖核酸開關不僅能感受信號還能使細胞針對信號變化做出相應的反應，并且不需要蛋白質的參與，具有結構簡單、反應迅速等優點。自發現其原理以來，人們通過模擬天然核糖核酸開關的調控機理設計出一系列人工核糖核酸開關，并將這些核糖核酸開關成功應用于調控細菌的趨化性、構建電子基因線路、開發生物傳感器等方面，近年來也致力于將其作為微生物細胞工廠的智能化精細調控工具而開發應用。因此本文將對核糖核酸開關的作用機制及其應用前景進行綜述。

圖1 核糖核酸開關的結構Fig.1 Architecture of riboswitch

1 核糖核酸開關的種類及作用機制

隨著對核糖核酸開關研究的逐步深入，現已發現至少有20種天然的核糖核酸開關（表1）。這些天然的核糖核酸開關可以按照配體的不同分為5類，分別是響應離子、糖衍生物、氨基酸、核酸衍生物以及響應輔酶的核糖核酸開關，下面將對這些天然的核糖核酸開關的種類及作用機制進行簡要綜述。

表1 核糖核酸開關的種類Table 1 Class of riboswitches

1.1 離子配體的核糖核酸開關

微生物生活在包含各種離子的環境中，這些離子參與生物體內很多重要的催化反應，如Mg2+是DNA聚合酶的輔酶，如果缺少Mg2+，DNA聚合酶的效率會顯著降低；但是離子過多則會對細胞造成毒害，使細胞死亡。因此維持細胞內的離子內穩態至關重要。早先的研究表明微生物主要通過蛋白質來調控離子轉運蛋白的表達從而維持細胞內的離子內穩態。近年來，許多研究表明一些位于離子轉運蛋白5′-UTR的核糖核酸開關也能感受離子濃度并通過變構效應調控離子轉運蛋白的表達。

迄今為止，發現的能識別離子的核糖核酸開關有Mg2+核糖核酸開關[17-18]、F?核糖核酸開關[19]、Ni2+、Co2+核糖核酸開關[20]。這些識別離子的核糖核酸開關能夠感受細胞內離子的濃度，高濃度狀態下核糖核酸開關打開，使下游編碼的轉運蛋白的基因表達；低濃度狀態下核糖核酸開關關閉，抑制下游轉運蛋白的表達[圖2(a)]，從而維持細胞內離子的內穩態，維持細胞正常生理過程。

1.2 糖衍生物配體的核糖核酸開關

目前只發現一種能識別葡糖衍生物——葡糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-phosphate，GlcN6p）的核糖核酸開關，這種核糖核酸開關被命名為glmS。glmS主要存在于各種革蘭陽性菌中，其中很多都是人類的病原菌。

glmS是現已發現的天然核糖核酸開關中一種非常獨特的核糖核酸開關，其作用機制不同于一般的調控轉錄的提前終止或者是抑制核糖體與核糖體結合位點（ribosome binding site，RBS）的結合。glmS是一種自剪切核酶，其位于基因glmS（編碼谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺轉移酶，可利用果糖-6-磷酸和谷氨肽合成GlcN6p參與糖代謝和細胞壁的生物合成）的5′-UTR，通過變構效應對GlcN6p的合成起反饋抑制作用[21]。當細胞內GlcN6p濃度較高時，GlcN6p與glmS結合，glmS的酶活增強，降解谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺轉移酶的前導mRNA，減少GlcN6p的合成量[圖2(b)]。GlcN6p是細胞壁成分N-乙酰葡糖胺的前體物質，GlcN6p量的減少會導致細胞壁合成障礙，因此可以利用glmS作為開發新藥的靶位點，用來抵抗細菌的多重耐藥性機制，研制新型抗生素[22]。

圖2 天然核糖核酸開關調控機制Fig.2 Regulatory mechanism of natural riboswitches

1.3 氨基酸配體的核糖核酸開關

現已發現兩種受核糖核酸開關調控表達的氨基酸，分別是甘氨酸和賴氨酸。

甘氨酸核糖核酸開關的結構非常特別，它是發現的天然核糖核酸開關中唯一一個串聯了兩個識別同一配體的AD和一個ED構成的核糖核酸開關。并且兩個AD表現出與甘氨酸結合的協同性，推測這種機制能夠使核糖核酸開關對配體的親和性變強，提高調控系統的靈活性[23]。當細胞內甘氨酸濃度較高時，甘氨酸與AD結合，使gcvT基因的5′-UTR區原本存在的前終止子結構被破壞，轉錄出完整的mRNA，使gcvT基因表達[圖2(c)]。因此，甘氨酸核糖核酸開關還是一種罕見的與配體結合后使下游基因表達的“ON”開關。

賴氨酸核糖核酸開關通常位于基因lysC的5′-UTR區，由能識別賴氨酸的AD和包含有RNAaseE識別位點的ED組成。當細胞內賴氨酸濃度高時，賴氨酸與AD結合促使ED變構暴露出RNAaseE識別位點，從而降解新生的mRNA[圖2(d)]，實現對賴氨酸的反饋抑制[24-25]。

1.4 核酸衍生物配體的核糖核酸開關

c-di-GMP、c-di-AMP和7-氨甲基-7-去氮雜鳥嘌呤（7-aminomethyl-7-deazaguanine，preQ1）等核酸衍生物均有相應的核糖核酸開關，通過與核糖核酸開關結合后的變構效應來調控基因的表達。以c-di-GMP核糖核酸開關為例介紹其作用機制。

c-di-GMP是細胞內最主要的第二信使分子，能調控多種重要的生理過程，如調控病原菌的毒力、鞭毛的運動以及生物膜的形成等[26]。2008年耶魯大學的Breaker課題組首次通過比較基因組學發現多種微生物基因組中普遍存在保守的GEMM motif，GEMM motif能識別c-di-GMP并能影響相關下游基因的表達。經過實驗驗證GEMM是一類能識別c-di-GMP的核糖核酸開關[27]。研究發現，病原菌梭狀芽胞桿菌（Clostridium difficile）中調控其毒力基因的5′-UTR區存在一類c-di-GMP核糖核酸開關，這類核糖核酸開關是一種自剪切核酶，被Breaker命名為I型自剪切核酶（Group I self-splicing ribozyme）。這類核酶通過與c-di-GMP的結合暴露或者覆蓋住其自身的切割位點，從而阻止或者開始下游基因的表達[28]。

1.5 輔酶配體的核糖核酸開關

硫胺素焦磷酸（thiamine pyrophosphate，TPP）、黃素單核苷酸（flavin monoucleotide , FMN）、腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）等都是重要的輔酶，分別參與細胞內的脫羧反應、氧化還原反應以及甲基轉移過程，對于維持細胞的內穩態至關重要。通過比較基因組學分析發現，多種細菌基因組中普遍存在保守的響應這些輔酶的核糖核酸開關，與相應的輔酶結合后發生變構從轉錄水平或翻譯水平調控相關基因的表達。基于這些輔酶的重要生理作用和獨特的調控機制，可以認為這些核糖核酸開關是RNA世界的遺跡。

2 人工核糖核酸開關的設計

天然的核糖核酸開關可以同時作為生物感受器和效應器——感受細胞內小分子代謝物或金屬離子的濃度并根據相應的濃度調控相關基因的表達從而使細胞維持內穩態以適應周圍的環境。核糖核酸開關的這種特性，可用于開發智能化的精細調控工具，優化細胞工廠的調控網絡。然而天然核糖核酸開關的配體多為細胞的初級代謝產物，存在調控的背景干擾過強的問題，因此設計識別細胞內原本不存在的配體的人工核糖核酸開關將更有利于實現細胞工廠的智能化調控。

2.1 基于控制轉錄提前終止原理設計核糖核酸開關

某些基因的5′-UTR存在一些不依賴于Rho的終止子結構，天然的核糖核酸開關AD與配體結合后會使ED變構導致ED的部分序列與終止子序列形成W-C配對，從而破壞5′-UTR天然的終止子結構，使基因能夠轉錄。基于這一原理，M?rl課題組設計了一系列在轉錄水平調控基因表達的人工核糖核酸開關[29]。他們的設計策略是在茶堿適體的3′端和終止子結構的聚尿嘧啶尾巴之間隨機插入不同長度的核苷酸，利用軟件RNA fold模擬插入序列能否與聚尿嘧啶尾巴形成類似終止子的莖環結構，再通過報告基因的顏色變化進行篩選，最后得到一個人工設計的能阻止轉錄提前終止的核糖核酸開關。當沒有茶堿時，ED形成終止子結構轉錄不能進行，添加茶堿后，茶堿與AD結合，終止子結構被破壞，轉錄開始，目標基因表達[圖3(a)]。

2.2 基于控制RBS與核糖體結合原理設計核糖核酸開關

通過控制RBS與核糖體的結合來調控翻譯的起始，是天然核糖核酸開關最常用的兩種調控策略之一，天然的核糖核酸開關AD與配體結合后會導致RBS被遮蓋或者暴露，從而抑制或起始目標基因的翻譯過程。利用這一機制，Gallivan等[30]設計了一系列人工核糖核酸開關。其設計思想是在茶堿適體和RBS之間隨機插入不同長度的核苷酸，通過報告基因cat對四環素的抗性篩選，分別得到響應茶堿后表達cat基因的“ON”核糖核酸開關和響應茶堿后抑制cat基因表達的“OFF”核糖核酸開關[圖3(b)]。

2.3 基于控制mRNA提前降解原理設計核糖核酸開關

有些天然核糖核酸開關本身是自剪切核酶，如GlcN6p核糖核酸開關，與配體結合后暴露出酶切位點，降解目標基因的mRNA。基于這一原理，耶魯大學的Breaker課題組將一個ATP適體與錘頭狀核酶通過一段隨機序列的交流模塊連接起來，通過外加ATP，觀察錘頭狀核酶能否自剪切，最終得到兩種具有自剪切核酶功能的人工核糖核酸開關，一種加入ATP后使核酶自剪切，一種加入ATP后能夠抑制核酶的自剪切[31][圖3(c)]。

圖3 人工核糖核酸開關設計原理Fig.3 Principle of design artificial riboswitch

3 核糖核酸開關在細胞工廠中的應用

3.1 應用于工業菌株的篩選和途徑的精細調控

性狀優良的菌株是發酵工業的靈魂，傳統方法往往是對出發菌株進行物理或化學誘變，再通過對突變文庫進行人工篩選來檢驗有沒有理想的高產菌株。但這種方法對環境和實驗人員的傷害較大，而且誘變不能針對某一特定性狀，基因的隨機突變導致突變文庫較大，很難篩選到理想的工業菌株。天然核糖核酸開關的效應物大多是一些初級代謝產物，這些核糖核酸開關可以特異性地針對某種代謝產物在細胞內行使反饋調節的作用。因此可以利用核糖核酸開關對代謝途徑進行精細調控，提高目標產物產量。例如Zeng課題組在生產賴氨酸的工業菌株谷氨酸棒狀桿菌LP917（Corynebacterium glutamicumLP917）基因gltA（編碼檸檬酸合酶）的5′-UTR區插入響應賴氨酸的核糖核酸開關，通過外加賴氨酸抑制檸檬酸合酶的轉錄，使菌體積累草酰乙酸。草酰乙酸作為合成賴氨酸的前體物質，它的積累能提高賴氨酸的產量，進一步抑制檸檬酸合酶的產生，形成一個正循環，提高工業菌株中賴氨酸的產量[32]。利用這種方法，他們成功使賴氨酸的產量提高了63%。

Jung課題組[33]采用另一種策略構建了包含賴氨酸核糖核酸開關和tetA基因[34]（編碼四環素/H+轉運蛋白，少量表達能夠抗四環素，大量表達會使細菌對Ni2+類金屬離子敏感）的篩選系統。在培養基中添加NiCl2作為篩選壓力，菌體內賴氨酸濃度高，抑制tetA基因的表達，使菌體對NiCl2不敏感，能夠存活；而當菌體內賴氨酸濃度低，tetA基因表達，菌體對NiCl2敏感，死亡。因此經過幾輪的篩選和富集，最終得到的就是高產賴氨酸的菌株。Jung課題組構建的這種基于核糖核酸開關來篩選高產菌株的平臺，只要能找到響應效應物的核糖核酸開關就能定向地篩選到高產菌株，具有針對性強、適用范圍廣、操作簡單等優點。

此外，工業發酵過程會產生大量的發酵熱，不僅影響微生物的生長和生產，還因冷卻控溫增加了生產成本，因此發酵工業迫切需要耐熱的底盤宿主。基于溫度變構原理，人工設計響應不同溫度的核糖核酸開關[35]，使熱激蛋白（heat shock protein，HSP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）等能提高微生物耐熱性的耐熱元件在不同溫度下依次表達，不僅能提高微生物的耐熱性還能減少能耗，保護環境。

綜上所述，利用核糖核酸開關來構建的工業菌株篩選方法具有特異性強、靈活度高、對環境和實驗人員危害小等優點，是一種簡便高效的篩選工業菌株的方法，在發酵工業上有巨大的應用價值。

3.2 應用于新藥開發

隨著抗生素類藥物的廣泛使用，細菌的多耐藥現象引起了人們的關注，近30年來研發的新型抗生素藥物屈指可數，甚至出現了“抗生素悖論”效應。傳統抗生素的作用機制僅限于阻礙核酸的合成、干擾蛋白質的合成、影響細胞膜和細胞壁的功能，因此亟需找到新型藥物作用靶點，利用特異性的調控作用來抑制致病基因的表達。核糖核酸開關在細菌中普遍存在并參與細菌基本生命代謝的重要過程，將核糖核酸開關作為研發新藥的作用靶點[36]，大大拓展了傳統抗生素的作用機制，為解決多重耐藥性問題提供了嶄新的思路。

氟化物在ATP或GTP結合二價金屬離子的過程中能模擬ATP或GTP的γ磷酸基團[37]，從而阻斷很多酶的活性[38]，對各種有機體都有毒性。病原菌中存在天然的響應氟離子的核糖核酸開關，當細胞內氟離子過多時，開關打開，表達氟離子轉運蛋白，外排出過多的氟化物從而維持細胞內氟離子的內穩態。開發新藥使氟離子更多地進入細胞，打破病原菌內的氟離子內穩態，則能有效殺死病原菌。基于這一思想，Breaker課題組在病原菌中構建了一個高效篩選系統，這個系統包含響應氟離子的核糖核酸開關和報告基因lacZ。將含有高效篩選系統的病原菌涂在含有X-gal和氟化物以及不同藥物的培養基上，通過顏色的變化判斷哪種新藥能使更多的氟離子進入細胞，通過一系列實驗發現短桿菌肽作用于細胞膜上的氟離子通道，使更多的氟離子進入細胞，從而殺死病原菌[39]。通過短桿菌肽輔助氟離子殺菌的方式能有效抑制口腔病原菌的生長，對治療齲齒有良好的效果。

glmS核糖核酸開關與配體GlcN6p結合后抑制谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺轉移酶的表達，導致產物GlcN6p的量減少，而GlcN6p是細菌細胞壁N-乙酰葡糖胺的前體，減少GlcN6p將抑制細菌細胞壁的合成。利用這一思路，Soukup課題組設計了一系列GlcN6p的結構類似物，其中有兩個能有效與glmS核糖核酸開關結合發揮抑菌作用[40]。這兩種GlcN6p的結構類似物可以作為新藥作用于含有glmS核糖核酸開關的多種病原菌。

Gallivan課題組在大腸桿菌中構建了一個調控大腸桿菌趨化性[41]的系統，這個系統由茶堿核糖核酸開關和調控鞭毛旋轉的cheZ基因組成。通過外源添加茶堿，使CheZ表達，控制細菌向茶堿方向移動[42]。利用這種改變細菌趨化性的策略，可以使攜帶藥物工程菌向病灶聚集增強治病能力。

3.3 作為酶分子定向進化的高通量篩選方法

細胞工廠通過酶的催化作用生產各種滿足人類需要的化合物，可以說酶的催化作用是工業發酵的核心。然而，許多天然酶具有與底物識別的專一性差、催化效率低以及熱穩定性差等問題，需要對其進行改性才能滿足工業生產的需求。

定向進化是一種有效的酶改性策略，可以通過易錯PCR等方法對編碼基因進行隨機突變或重組，使其原有活性提高或者產生新的功能。由于隨機突變后產生的文庫較大，篩選難度高，定向進化成功的關鍵在于能否針對目標特性開發出高效的篩選方法。核糖核酸開關在微生物中普遍存在并且能響應特定的效應物調節目標基因的表達，因此可作為一個有效的篩選模塊，為開發高效篩選方法提供嶄新的思路。Smolke課題組將響應茶堿的適體與自剪切核酶融合后構建了能響應茶堿的核酶開關，當沒有茶堿時該核糖核酸開關結構不穩定會降解目標基因的mRNA，抑制目標基因的表達；只有當茶堿與適體結合后核酶結構穩定，才能表達目標基因。將這個人工設計的核糖核酸開關構建到咖啡因脫甲基酶與綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合的蛋白質的3′-UTR區，可以用于咖啡因脫甲基酶的定向進化。因為咖啡因脫甲基酶能夠將咖啡因轉化成茶堿，而茶堿是該核糖核酸開關的配體，通過熒光強度的不同利用流式細胞儀（fluorescence activated cell sorter，FACS）篩選到酶活提高了32倍的咖啡因脫甲基酶[43]。

3.4 構建新型生物傳感器

生物傳感器是將生物識別元件和信號轉換元件緊密結合，從而檢測目標化合物的分析裝置。將核糖核酸開關與報告基因（beta-半乳糖苷酶、熒光蛋白、熒光素酶）串聯在一起，通過報告基因的表達強度來判斷相應的配體濃度，開發出各種新型生物傳感器。這些新型生物傳感器與傳統的生物傳感器相比，不需要借助細胞外的各種光學元件或者壓電裝置，可以直接將細胞內部某一代謝物的濃度信號轉化為顏色變化等輸出信號。具有結構簡單、反應靈敏、價格低廉、生物安全性高等優點，可以廣泛應用于食品藥品的檢測等方面。如Gu等[44]將天然的響應腺苷鈷胺素（adenosyl-cobalamin, AdoCbl）的核糖核酸開關構建到GFP的5′-UTR區，通過熒光強度的變化來檢測B12的濃度，利用這種方法對AdoCbl的檢測限達到10 ng·ml?1，相當于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）的水平。

融合適體與核酶構建成的人工適體酶(aptazyme)能將與靶分子結合的信號穩定轉換成更清晰的酶學信號，如自切割活性，通過在適體酶上標記放射性核素或熒光基團，能夠檢測到微量濃度的配體[45]。

2011年Jaffrey等[46]利用RNA成功模擬了綠色熒光蛋白，設計出一種名為Spinach的核糖核酸開關，結合底物DMHBI之后會發出綠色熒光。通過將Spinach與相應不同的適體融合，開發出能檢測c-AMP- GMP[47]、腺苷酸、ADP、SAM、谷氨酰胺和GFP[48]的核糖核酸開關。綜上所述基于核糖核酸開關開發的生物傳感器是一種檢測發酵工業中某種特定產物的有效手段。

4 結論與展望

自2002年Breaker首次提出核糖核酸開關這個術語[49]，對于核糖核酸開關的研究已經整整13年，工程化的核糖核酸開關已經不再僅僅是一個構想，而被用于在各種工業微生物中構建具有魯棒性和正交性的調控系統，利用不同的調控機制對細胞工廠進行智能調控。目前，工程化的核糖核酸開關已經成功應用于篩選工業菌株、研發新藥、構建酶分子的定向進化的篩選方法以及開發新型生物傳感器等方面。

與基因表達的蛋白調控系統比較，核糖核酸開關調控基因的表達不需要蛋白質的參與，具有免疫原性小、結構簡單、反應迅速等優勢。然而天然核糖核酸開關響應的效應物大多是細胞內的初級代謝產物，利用天然核糖核酸開關開發的細胞內調控系統存在背景干擾過強的問題。針對這一現象，可以以細胞內不存在的物質作為配體設計人工核糖核酸開關，能有效區分核糖核酸開關調控的基因是受細胞內源配體影響還是外加配體影響，解決細胞內調控背景干擾過強的問題。除此之外，核糖核酸開關的工業化應用還存在一個問題——難以篩選到合適的響應非細胞內天然產物的適體。雖然理論上任何一種物質都能在體外篩選到相應的適體，然而大量實驗證明體外篩選到的適體大多不能在體內起作用，這可能是因為體內的環境與體外不同所導致的。而這一問題大大限制了核糖核酸開關的應用，因此，如何開發出更多的能在體內響應不同配體的適體是核糖核酸開關在工業化應用進程中的一大挑戰。

符 號 說 明

AD——核糖核酸開關的適體區

AdoCbl——腺苷鈷胺素

c-di-AMP——單磷酸腺苷環二聚體

c-di-GMP——單磷酸鳥苷環二聚體

FACS——流式細胞儀

FMN——黃素單核苷酸

GFP——綠色熒光蛋白

GlcN6p——葡糖胺-6-磷酸

HPLC——高效液相色譜

HSP——熱激蛋白

ORF——開放閱讀框

PHA——聚羥基脂肪酸酯

PHB——聚羥基丁酸酯

preQ1——7-氨甲基-7-去氮雜鳥嘌呤

RBS——核糖體結合位點

SAM——腺苷蛋氨酸

SOD——超氧化物歧化酶

TPP——硫胺素焦磷酸

UTR——非翻譯區

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Intelligent and fine regulation of microbial cell factory based on riboswitches

ZHAO Yujia，ZHANG Genlin，ZHOU Xiaohong, LI Chun
（Department of Bioengineering,College of Life Science,Beijing Institute of Technology,Beijing100081,China）

Construction of the microbial cell factory is one of the developmental directions of current green chemical industry. The microbial cell factory is a kind of recombined microorganism and its metabolic and regulatory pathways have been reconstructed by metabolic engineering and synthetic biology to synthetic new compounds or to improve the yield of target production. The microbial metabolic pathway is regulated by two points: environment and genetic information. The cell maintains its homeostasis by global transcription factors, messenger molecules and feedback inhibition when the circumstance is changed. Meanwhile, the cell is affected by its own genetic circulate through transcription, translation and post-translational modification to regulate the expression of target gene. The riboswitches are RNA elements which change their conformation when bind to specific ligands such as ions, sugar derivatives, amino acids, nucleic acid derivatives and coenzymes to regulate the process of transcription, translation and splicing of mRNA. The riboswitches are natural biosensors and bioeffectors which can be designed as the intelligent molecular tools to fine regulate microbial cell factories. Using riboswitches in the microbial cell factory can extend the application in the field of chemical, pharmaceutical, environmental protection and food production.

Prof. LI Chun, lichun@bit.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20150935

TQ 936.2

：A

：0438—1157（2015）10—3811—09

2015-06-16收到初稿，2015-07-16收到修改稿。

聯系人：李春。

：趙雨佳（1989—），女，博士研究生。

國家杰出青年科學基金項目（21425624）；國家自然科學基金面上項目（21376028，21476026）。

Received date: 2015-06-16.

Foundation item: supported by the National Science Fund for Distinguished Young Scholars（21425624）and the National Natural Science Foundation of China(21376028, 21476026).