容積負荷變化模式對嗜鹽混合菌發酵乙酸合成PHB的影響

崔有為，張宏宇，冀思遠，施云鵬

（北京工業大學環境與能源工程學院，北京 100124）

容積負荷變化模式對嗜鹽混合菌發酵乙酸合成PHB的影響

崔有為，張宏宇，冀思遠，施云鵬

（北京工業大學環境與能源工程學院，北京 100124）

以嗜鹽混合菌發酵生產PHB具有免滅菌程序、易提取、產量高等優勢而被廣泛關注。本研究集中考察了嗜鹽混合菌（MMCs）發酵生產PHB過程中調整容積負荷的方式對PHB生產的影響。在研究中通過比較恒定接種生物量改變底物濃度以及恒定底物濃度調整接種生物量兩種調整方式下PHB發酵生產的最大細胞含量、PHB最大容積產率以及表觀動力學，確定了MMCs的最佳OLR，以及兩種變化方式的本質差異。研究結果表明，兩種方式下隨著OLR升高，細胞內最大PHB的積累量和PHB容積產率也隨著增加。本研究發展的嗜鹽MMCs最佳OLR=0.91 kg·(kg·d)?1。在相同的OLR下，高的接種生物量始終具有高的碳源轉化率和底物消耗速率。為此，采用高接種生物量發酵生產PHB可以提高PHB生產效率并降低PHB的成本。

聚羥基丁酸酯（PHB）；有機容積負荷（OLR）；污泥濃度；底物濃度；嗜鹽混合菌

引 言

很多微生物（包括細菌和古菌）在不平衡生長時會在體內積累聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHA）。聚合物PHA具有良好的物理特性、生物相容性和生物可降解性，被認為是替代以石油為原材料化工合成塑料的重要物質[1]。PHA替代工業塑料可以解決塑料填埋產生的污染問題，并對緩解石油等化石燃料短缺問題具有重要意義[2-5]。但是，生物生產PHA從成本上無法和化學合成的塑料競爭。為此，基于生物合成PHA的研究都集中在如何降低成本上。目前，以混合微生物（mixed microbial cultures，MMCs）替代純菌（pure cultures，PCs）生產PHA由于可以減少滅菌程序和可以使用廢棄底物被認為是降低PHA生產成本的有效方式[6-8]。近年來，選擇富集活性污泥中具有高積累PHA能力的MMCs研究已經取得了很大的進展。采用好氧動態進料方式（aerobic dynamic feeding，ADF）下選擇的活性污泥中PHA積累微生物比例會大大增加[9-10]。在此基礎上可以利用單一或者復合底物，甚至是廢棄物合成PHA[6,11-12]。除了淡水MMCs，嗜鹽微生物（halophiles）被報道具有比淡水微生物更強的PHA積累能力[13]。Haloarcula marismortui[14]，Cupriavidus necator[15]，Halomonas campisalis[16]等嗜鹽PCs都被報道可以儲存高含量的PHA，并且在回收細胞內PHA上也具有成本優勢。但是，嗜鹽MMCs的研究還未見報道。

在前期的研究中采集入海口底泥利用ADF篩選方式成功實現了對嗜鹽MMCs的富集和篩選[17]。在此基礎上，本研究將集中討論影響嗜鹽MMCs發酵生產PHA能力的過程因素。目前，生物生產PHA普遍采用兩步法，即第1步篩選富集高PHA積累能力的菌群；第2步在限氮條件下進行PHA發酵生產。在兩步法工藝中的第2步，接種富集的MMCs在營養物質限制的條件下發酵使MMCs最大程度地將外源碳合成PHA是決定PHA生產能力和產量的關鍵一步。在影響發酵的條件因素中，發酵使用的底物量和初始接種的生物量的比值（F/M）決定了有機物的利用速度，生物增殖速度以及溶解氧利用速率，被認為是影響發酵生產PHA產量的重要因素[6-7,12,18]。在活性污泥法工藝中，F/M 是通過有機容積負荷（organic loading rate, OLR）表征的。Venkateswar等[7]在研究中通過改變進水有機物濃度而調整OLR發現PHA積累量和OLR呈正比，即進水有機物濃度越高MMC積累的PHA越高。然而，Dai等[12]在利用從小黑楊水解產生的木質素材料生產PHA的實驗中同樣改變OLR，卻發現PHB的積累量僅僅取決于最初的糖負荷，而和反應器中的總糖濃度無關。這兩個研究雖然都是基于OLR的探索，但是由于不同的變化OLR方式（Venkateswar等的研究通過改變進水有機物濃度，Dai等的研究通過改變污泥濃度）得出了相反的結論。這說明F/M作為一個綜合因素，通過改變有機物濃度或者污泥濃度會對混合菌PHA積累產生不同的影響。在發酵階段可以通過一次投加進水和分批投加進水方式來實現OLR的調控[6-7]。分批投加底物的方式本質是固定接種微生物濃度，通過若干次改變底物濃度來實現動態的有機物濃度變化，即動態的OLR的調節。從這個角度看，分批投加底物本質上是若干個一次性投加底物的組合。基于此，本研究針對嗜鹽MMCs系統采用一次性投加底物的方式研究OLR變化模式對PHA積累的影響，從操作策略層面探索利用嗜鹽MMCs最大限度地提高PHA產率和提高碳源利用率的方法。

1 實驗材料和方法

1.1 嗜鹽PHA積累混合菌的選擇和富集

實驗中所用的嗜鹽污泥采自河北省秦皇島市某河道入海口底泥。該地為人類活動較為頻繁地區。將采集的河底淤泥經過反復淘洗得到嗜鹽活性污泥[17,19]，接種該污泥到間歇發酵反應器中進行PHA積累菌群的篩選。菌群選擇反應器為雙層玻璃夾心反應器，有效體積為2 L。反應器外接恒溫水浴裝置保證在整個過程中溫度控制在（30±0.1）℃。發酵反應器配有曝氣充氧設備和攪拌裝置。在該發酵反應器中采用ADF方式，按照Johnson等[9]提出的篩選方法進行PHA菌群的選擇。具體篩選參數為：每天2個發酵周期，每個周期12 h，包括進水5 min，好氧曝氣11.5 h，沉淀20 min，排水5 min。污泥齡（sludge retention time，SRT）控制在15 d。選擇期間使用的底物中乙酸濃度為（863±30）mg·L?1（由分析純的乙酸鈉配制）。營養物質和微量元素濃度見表1。底物中鹽度以投加NaCl保持穩定在（30±1）g·L?1，實現高鹽環境以保證嗜鹽微生物能夠進行正常的代謝活動。同時在底物中投加硫脲（20 mg·L?1）以達到抑制硝化作用的目的。按照該方式連續運行200多個周期，完成了對MMCs的篩選。

表1 合成廢水組分Table 1 Component of synthetic wastewater/mg·L?1

1.2 OLR變化方式對嗜鹽MMC生產PHB影響實驗

OLR變化方式對嗜鹽MMC生產PHB影響實驗是針對兩步法生產PHA中的第2步發酵過程而開展的實驗。即采用富集的MMC進行發酵生產PHA，考察發酵中OLR對該菌群發酵生產PHA能力。實驗中通過固定污泥濃度改變進水底物濃度和固定進水底物濃度改變污泥濃度兩種變化方式調整了4個OLR梯度，即0.55，0.75，0.95，1.50 kg·(kg·d)?1。具體實驗參數見表2。固定進水乙酸濃度改變MLVSS實驗中，發酵底物進水乙酸濃度保持在（2500±100）mg·L?1，通過調節污泥濃度改變OLR；固定污泥濃度改變發酵底物乙酸濃度實驗中的MLVSS保持在（1400±100）mg·L?1，通過調節進水底物濃度改變OLR。8組實驗的連續發酵時間均為48 h。每組實驗都設置1組平行實驗，兩次實驗的平均值作為最終結果。根據報道兩步法生產PHA的第2步要求嚴格限制氨氮的投加從而抑制微生物的生長實現PHA在細胞內的最大積累[20]。因此，在發酵實驗中的發酵底物只含有乙酸和營養元素，不含有氨氮。除氨氮外，其他營養元素和微量元素濃度同表1。

1.3 分析方法

氨氮、MLSS和MLVSS采用標準方法進行測定[21]。乙酸含量的測定采用氣相色譜分析法（Agilent 7890A氣相色譜儀）[21]。PHA含量在樣本經過前處理后采用內標法進行氣相色譜分析[22]。樣品前處理具體操作過程如下：從反應器中取出40 ml泥水混合物，4000 r·min?1離心后棄去上清液，加入1 ml次氯酸鈉消毒液以使微生物失活，水洗兩遍后冷凍干燥。稱取凍干后的污泥樣品約25 mg于具塞消解管中，依次加入2 ml氯仿、2 ml苯甲酸鈉溶液，于105℃消解20 h，冷卻后加入1 ml去離子水，搖勻、離心，取下層有機相于盛有0.5 g左右無水硫酸鈉的2 ml塑料離心管中，搖勻。8000 r·min?1轉速下離心5 min，隨后取有機相進行氣相色譜分析。由于實驗采用單一乙酸作為底物，嗜鹽混合污泥合成的PHA是單一的聚羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）[23]，未在PHA中測量檢出其他單體組分。

表2 批次實驗參數設置Table 2 Parameter applying in batch experiments

1.4 表觀參數的計算

PHA容積產率

細胞內PHA濃度

碳源的PHA轉化率

PHA 比合成速率

底物比吸收速率

式中，WP為PHA質量，mg；m為PHA分子量，其中PHB為21.5 mg·(mmol C)?1；CDW為細胞干重（cell dry weight），mg；T為達到PHA積累最大值時長，h；PHA0為初始細胞內的PHA含量，mmol C·L?1；PHAmax為細胞內的PHA含量最大值，mmol C·L?1；S0為初始乙酸濃度，多次投加時為投加乙酸濃度的總和，mmol C·L?1；Sf為PHA含量最大時乙酸濃度，mmol C·L?1；Xa為反應器中生物量，mmol C·L?1。

2 實驗結果與討論

2.1 改變污泥濃度調整OLR對PHB積累的影響

由于在發酵反應中氮素被限制而微生物無法增殖[24]，因此在整個發酵過程中，微生物濃度和初始接種在發酵反應中的生物量一致。根據以往報道[12]，在PHA合成混合菌系統中，普通發酵OLR在0.9 kg·(kg·d)?1左右。為充分驗證變化OLR方式對發酵的影響規律的重現性, 實驗從低到高設置4個OLR梯度。本實驗恒定底物濃度為（2500±100）mg·L?1，降低接種生物量調整OLR分別達到0.56，0.75，0.91和1.49 kg·(kg·d)?1。圖1（a）～（d）分別是發酵期間4個OLR反應器內的底物利用和PHA合成情況。從圖中可以看出 OLR從0.56 kg·(kg·d)?1增長至0.91 kg·(kg·d)?1，PHB積累的最大細胞含量從23.3%逐漸增加到37.2%，而PHB的容積產率從557.6 mg·L?1逐漸下降到524.2 mg·L?1。由于微生物在限制氮素的條件下無法進行細胞增殖，為此PHB的容積產率直接由最大的PHB細胞含量和微生物量決定。盡管PHB最大細胞含量隨著相對外源碳源供給量的增加而逐漸增加，但是生物量仍然是PHB容積產率的決定因素。OLR影響PCs發酵最大PHA積累已被報道[25]，本研究結果也表明在MMCs體系內，相對高的碳源供給量促進微生物內PHB的積累。但是，繼續增加OLR到1.49 kg·(kg·d)?1時，細胞內PHB最大含量卻下降至23.6%，而PHB的容積產率也下降至204.1 mg·L?1。實驗結果表明采用過小的生物接種量，雖然可以極大地提高碳源的可利用性，但是最終卻沒有提高細胞內最大PHB積累量和最大的PHB產量。造成這種現象的原因可能是由于過低的生物量會導致底物利用速率的下降，致使利用乙酸合成能量只能維持生物存活，而無法將外源有機物持續轉化成內源PHB。此外，由于過低的PHB細胞含量不利于PHB的提取，所以綜合4個OLR實驗結果可以確定最優的OLR=0.91 kg·(kg·d)?1。從圖1還可以看出降低接種生物量提高OLR還會影響到PHB積累和底物降解的同步性。4個OLR下發酵細胞達到最大PHB含量的時間依次是10，10，12和24 h，乙酸降解完成時間分別是8，12，12和48 h。在OLR=0.56～0.91 kg·(kg·d)?1范圍內，乙酸降解完成時間均和細胞內PHA積累最大時刻同步發生。說明乙酸被微生物充分利用而合成PHB。但是，在OLR=1.49 kg·(kg·d)?1下，PHB積累結束時間早于乙酸降解完成時間達到24 h。這種現象證明相對過高的碳源供給不利于PHB的積累。

圖1 調節污泥濃度改變嗜鹽活性污泥系統OLR實驗的PHB生產能力及其碳源利用情況Fig.1 PHB production capability and carbon source utilization in batch experiments of changing OLRs by adjusting halophilic activated sludge concentrations

2.2 改變底物濃度調整OLR對PHB積累的影響

恒定初始接種生物量[MLVSS=（1400±100）mg·L?1]，通過改變底物中乙酸濃度使OLR達到0.54、0.76、0.91和1.47 kg·(kg·d)?1。圖2（a）～（d）分別是發酵期間4個OLR反應器內的底物利用和PHB合成情況。從圖中可以看出，OLR由0.54 kg·(kg·d)?1增加至0.91 kg·(kg·d)?1時，隨著發酵底物中有機酸量的增加，細胞內最大PHB的積累量也隨著增加，分別為14.7%、21.6%、37.2%。同時，發酵的PHB容積產率也逐漸增加，分別是205.9，305.4和524.2 mg·L?1。以PHB產率和PHB細胞含量作為指標分析OLR=0.91 kg·(kg·d)?1為最優的OLR。但是，持續增加底物供給量至OLR=1.47 kg·(kg·d)?1，發酵獲得的細胞內最大PHB的積累量和PHB容積產率都降低。這樣的變化規律和恒定底物濃度改變接種量的實驗趨勢基本相同。此外，過高的底物供給也導致了PHB積累先于底物降解完成的情況。在OLR=0.54～0.91 kg·(kg·d)?1下，乙酸的降解完成的時間和細胞PHB積累最大所需的時間一致，分別為6、8、12 h。然而當OLR增加到1.47 kg·(kg·d)?1時，細胞內PHB達到積累最大所需的時間也延長至24 h。在發酵的48 h內乙酸持續被利用，乙酸總消耗量僅為約2700 mg，低于OLR=0.54 kg·(kg·d)?1時乙酸消耗量（2800 mg）。造成這種現象的原因可能是由于過高的發酵底物濃度抑制了微生物活性，同時也抑制生物的PHA合成。

圖2 調節進水底物濃度改變嗜鹽活性污泥系統OLR實驗的PHB生產能力及其碳源利用情況Fig.2 PHB production capability and carbon source utilization in batch experiment of changing OLR by adjusting influent substrate concentration in halophilic system

2.3 不同OLR改變方式發酵PHB的表觀動力學比較

根據生物積累PHB的線性模型[26]，OLR會影響PHB積累和底物利用，而在相同OLR下同時改變污泥濃度和底物濃度也可能會引起底物利用及PHB積累量的改變。批次實驗結果的表觀動力學分析見表3。在恒定進水底物濃度、降低污泥濃度提高OLR發酵實驗中，OLR從0.56 kg·(kg·d)?1升高至0.91 kg·(kg·d)?1時，底物利用速率沒有明顯變化，但PHB合成速率qP逐漸增加。說明在此范圍內降低污泥濃度提高OLR，不會改變碳源轉化成PHB的比率和底物的利用速率，但是卻加快了儲存速率。所以，在OLR=0.56～0.91 kg·(kg·d)?1范圍內盡管OLR的增加會導致PHB積累速率的增加，但由于碳源轉化率不變，等量的碳源投加不會改變PHB總產量。當OLR增加到1.49 kg·(kg·d)?1時，qP與qS明顯下降，碳源的轉化率也隨之降低。因此污泥濃度降低導致的 OLR過高抑制了微生物對底物的攝取速率，從而減緩了PHB合成速率，并且對微生物細胞存儲PHB能力有抑制作用。恒定污泥濃度、增加進水底物濃度提高OLR發酵實驗中，OLR=0.54 kg·(kg·d)?1、OLR=0.76 kg·(kg·d)?1和OLR=0.91 kg·(kg·d)?1時底物消耗速率差異不明顯，PHB合成速率有明顯的上升趨勢，從0.018 mmol C·(mmol C·h)?1增加到0.030 mmol C·(mmol C·h)?1。同時，碳源的轉化率也隨之上升。所以OLR在0.54～0.91 kg·(kg·d)?1范圍內，污泥濃度恒定時PHB合成速率和產量與底物濃度呈正相關，底物增加促進微生物將更多的碳源用于存儲合成PHB。

從2.1節和2.2節的數據可以看出，兩種變化OLR的方式似乎對PHB最大細胞積累含量的影響趨勢趨同，即OLR在0.55～0.95 kg·(kg·d)?1范圍內PHB最大細胞積累含量隨著OLR的增加而有所提高。這種不同調節OLR方式產生的影響趨同，其本質上是由于相對過量的外源碳源會促進PHB的積累導致的[25]。但是，這兩種OLR調整方式在動力學水平上卻存在著顯著的差異。在相同的OLR下，高的接種生物量始終具有高的碳源轉化YPHA/S和底物消耗速率qS。在進行發酵生產PHB的過程中，高的YPHA/S是發酵生產的目標，它意味著高的PHB生產效率和低的PHB成本。此外，根據2.1節和2.2節的數據，在相同的OLR下，高污泥接種量還會顯著提升PHB的容積產率和產量。為此，在使用相同OLR發酵生產PHB過程中，提高生物接種量會提高碳源的利用率及其PHB產量，對于降低PHB生產成本是有益的。本研究確定的嗜鹽MMCs發酵最佳OLR=0.91 kg·(kg·d)?1，對應的接種生物量為1410 mg MLVSS·L?1，底物乙酸濃度為2400 mg·L?1。

表3 不同調節方式下改變OLR時PHB合成的表觀動力學參數Table 3 Parameters of observed kinetics under different adjusting method to change OLR

3 結 論

本研究以篩選的嗜鹽MMCs作為對象，集中研究了發酵生產PHB中OLR的影響。研究表明以嗜鹽MMCs發酵生產PHB，不同調節OLR方式會對PHB發酵生產產生影響。在OLR=0.54～0.91 kg·(kg·d)?1內，提高OLR會提高PHB最大細胞積累含量和PHB容積產率。在相同的OLR下，高生物接種量具有高的PHB積累速率qP、碳源轉化率YPHA/S和PHB容積產率。污泥濃度一定，提高進水底物濃度會提升微生物細胞內PHB的積累量和反應器中PHB的總產量，并會提高底物向PHB的轉化率。在相同負荷下，提高接種生物量可以促進嗜鹽MMCs發酵的效率，降低PHB生產成本。研究也證明了采用嗜鹽MMCs在開放性的環境下生產PHA是可行的。同時，MMCs對OLR表現出很好的適應性。與PCs相比，MMCs有無需滅菌、底物負荷適應范圍廣、易于工程實現等優勢。

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Influence of organic loading rate change modes on PHB production by halophilic sludge fermenting acetate acid

CUI Youwei, ZHANG Hongyu, JI Siyuan, SHI Yunpeng
(College of Environmental and Energy Engineering,Beijing University of Technology,Beijing100124,China)

Polyhydroxybutyrate (PHB) production by halophilic mixed consortia draws a lot of attention because of its great advantages, such as no sterilization, extraction convenience and high production. In this study, halophilic mixed microbial cultures were used to investigate the influence of adjusting modes of the organic loading rate on PHB production. Two adjusting modes were applied including adjusting sludge concentration with a consistent substrate concentration and substrate concentration with a consistent sludge concentration. The maximum PHB content in cells, maximum PHB volumetric yield and kinetics were compared to confirm the optimum OLR and the key difference in the two modes. The experimental results showed that the high OLR led to a high PHB content in cells and a high PHB volumetric yield. In this study, 0.91 kg ?(kg ?d)-1was proved to be the optimum OLR for halophilic MMCs. On condition of identical OLR, the high sludge concentration led to high carbon source conversion ratio and substrate consumption rate. Then, a high sludge concentration can enhance PHB productivity and depress PHB production cost.

polyhydroxybutyrate (PHB); organic loading rate (OLR); sludge concentration; influence substrate concentration; halophilic mixed microbial cultures

Dr. CUI Youwei, cyw@bjut.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20150287

X 703

：A

：0438—1157（2015）10—4177—08

2015-03-10收到初稿，2015-05-25收到修改稿。

聯系人及

：崔有為（1977—），男，博士，副教授。

國家自然科學基金項目（51478011，51178004）；北京市自然科學基金項目（8132013）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃項目。

Received date: 2015-03-10.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (51478011, 51178004), Natural Science Foundation of Beijing (8132013) and the Importation and Development of High-Caliber Talents Project of Beijing Municipal Institutions.