誘導物及種間誘導對白腐菌的錳過氧化物酶(MnP)的誘導

鐘紫旋,劉 麗,張 勇,羅 鋒

(西南大學 資源環境學院 能源生物資源開發重慶市重點實驗室,重慶 400716)

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誘導物及種間誘導對白腐菌的錳過氧化物酶(MnP)的誘導

鐘紫旋,劉 麗,張 勇,羅 鋒*

(西南大學 資源環境學院 能源生物資源開發重慶市重點實驗室,重慶 400716)

本實驗通過添加外源誘導物誘導和不同白腐菌種間相互誘導兩種途徑來研究Trametesversicolor、Pleurotusostreatus、Dichomitussqualens、Bjerkanderaadusta四種白腐菌產MnP活性,發現這些白腐菌在一些誘導條件下可產生大量MnP。結果表明,外源誘導物中,2,5-二甲基苯胺是有效的MnP誘導劑,對四種菌產MnP均有不同程度的誘導作用。異丙醇能提高T.versicolor、P.ostreatus和D.squalens產MnP活性,且誘導效果優于乙醇。Cu2+能顯著提高T.versicolor和D.squalens產MnP活性。 Mn2+能顯著提高P.ostreatus和B.adusta產MnP活性。不同白腐菌相互作用時,T.versicolor、P.ostreatus和D.squalens三種菌兩兩共培養均有明顯的MnP種間誘導效果。本研究為大量產MnP并將其應用于工業提供可能。

白腐菌,錳過氧化物酶,外源誘導物,種間誘導

白腐菌是已知的唯一具有徹底降解木質素能力的真菌[1],這類真菌所分泌的非特異性氧化還原酶中,錳過氧化物酶(Manganese Peroxidase,MnP)對木質素降解起著至關重要的作用。此外,MnP對許多結構不同的高毒性、大分子、難降解的芳香族化合物具有廣泛的降解能力,包括氯苯、聯苯、苯胺、氯酚、以及硝基芳烴化合物等[2],能使這些底物經過多步反應逐步降解為二氧化碳和其它小分子產物。由于MnP對植物殘體的高效生物轉化作用,它們在紙漿和造紙、食品、紡織、染料等工業,生物修復等各種生物技術應用領域有著廣闊前景[2-4]。但MnP的有限來源是制約其大量產業化應用的關鍵難點,因此如何獲取大量MnP成為我們面臨的直接而現實的問題。

誘導物對MnP合成及表達具有重要作用,添加合適的外源誘導物是增加MnP產量最有效的方法之一。誘導物不僅能誘導MnP產量增加,還起到分散劑和保護劑的作用[3,5]。雖然單一培養的一些白腐菌MnP降解木質素機理已被較大程度的揭示[6],但對不同白腐菌共培養的生化和酶學性質研究較少。目前國內外有關白腐菌產MnP的研究仍主要集中于工業應用[4,7-9],而缺乏對白腐菌產MnP的外源化合物誘導和近緣種間誘導研究,MnP誘導表達調控機制尚不清楚[10]。另外,誘導物對MnP產量及活性的影響也因菌種而異,不同的菌種在不同的環境條件下其產酶所需的最適誘導物及其濃度差異較大。因此本實驗采用外源誘導物誘導和真菌種間相互誘導兩種途徑來對Trametesversicolor、Pleurotusostreatus、Dichomitussqualens和Bjerkanderaadusta四株白腐菌如何大量誘導產MnP進行初步研究。為進一步優化白腐菌MnP合成條件及構建MnP超量表達的工程菌株提供理論基礎,也為深入研究MnP誘導表達調控機制,將MnP廣泛應用于工業提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Trametesversicolor(NBRC30388),Pleurotusostreatus(NBRC30776),Bjerkanderaadusta(NBRC106826) 日本生物資源保藏中心；Dichomitussqualens(DSMZ9615) 德國微生物菌種保藏中心。

恒溫搖床 Thermo；全自動高壓滅菌鍋 TOMY；立式高速冷凍離心機 TOMY；UV2600紫外可見分光光度計 島津；冷凍搖床培養箱 IKA；霉菌培養箱 上海齊欣；干熱滅菌箱 松下。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌液制備 在100mL三角瓶中裝50mL PDB培養基,121℃高壓蒸汽滅菌20min。再分別從培養好的四種菌的PDA平板中取相同大小的菌塊(直徑Φ7mm)至50mL PDB培養基中,于28℃恒溫搖床中振蕩培養5d,轉速180r/min。用無菌勻漿器攪拌均勻,得到菌液。

1.2.2 外源誘導物誘導

1.2.2.1 不添加誘導物 以5%(v/v)的接種量接種菌液至50mL PDB培養基/100 mL三角瓶,搖床振蕩培養(28℃,180r/min),每隔48h取樣并離心(12000r/min,4℃,4 min),測定酶活,每組3個平行。

1.2.2.2 添加誘導物 在搖床振蕩培養第3d,分別添加0.1mmol/L CuSO4·5H2O,0.1mmol/L MnSO4·H2O,20g/L乙醇,20g/L異丙醇,0.5mmol/L 2,5-二甲基苯胺,0.5mmol/L 4-甲氧基苯胺,0.5mmol/L松柏醇,0.5mmol/L焦性沒食子酸,0.5mmol/L藜蘆醇,0.5mmol/L 2,6-二甲氧基酚(DMP)至上述四種真菌的PDB培養基中,繼續搖床振蕩培養,以1.2.2.1作為對照。每隔48h取樣并離心(12000r/min,4℃,4min),測定酶活,每組3個平行。

1.2.3 共培養 分別從培養好的兩種菌的平板中取相同大小的兩個菌塊(直徑均為Φ7mm),接種于新的同一PDA平板上,兩菌塊間保持約4cm距離,且距平板邊緣約2cm。將該平板放在恒溫培養箱中28℃培養7d左右(如圖4所示)。每組3個平行。從上述培養好的共培養平板中分別取中間交界線菌塊及兩種菌單獨培養菌塊(直徑均為Φ7mm)于2mL離心管中,并加入1mL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液,置于恒溫搖床中振蕩約8h,離心(12000r/min,4℃,4min)后取上清液測定酶活。

1.2.4 MnP活力測定 愈創木酚法[11-12]:測定體系中含0.4mmol/L愈創木酚,0.1mmol/L H2O2,0.2mmol/L MnSO4,50mmol/L(pH4.5)琥珀酸鈉緩沖液。通過加入H2O2啟動反應,測定反應液在465nm處吸光度隨反應時間的變化。

2 結果與分析

2.1 芳香族化合物對MnP活性影響

MnP能夠催化芳香族化合物的氧化反應,其催化反應過程是底物的單電子氧化,生成相應的活性自由基[2,13-14]。同時這些芳香類底物酚氧環上不同位置的取代也影響著MnP的合成。文獻報道一些大分子木質素及其亞結構類似物是木質素降解酶生成的有效誘導劑。有些研究者認為白腐真菌受誘導分泌木質素降解酶類,可能是用于從培養基質中消除某些有害芳香族化合物的毒害作用,因此可以提高木質素降解酶產量[15]。本實驗選擇了6種普遍使用的芳香族化合物來考察它們對T.versicolor、P.ostreatus、D.squalens和B.adusta四種菌產MnP活性的影響。

對四種菌產MnP有誘導現象的芳香族化合物如圖1所示(對相應菌無誘導現象的誘導物未在圖中顯示)。結果表明,2,5-二甲基苯胺是有效的MnP誘導劑,對該四種菌產MnP均有不同程度誘導效果。其中,添加2,5-二甲基苯胺后,T.versicolor、D.squalens和B.adusta都在培養的第7d MnP活性達到最大值,分別為5.76、18.39和81.62U/L,較對照組提高了18.77倍、2.52倍和1.56倍(圖1a,b,d),而P.ostreatus在培養的第13d酶活達到最大值6.02U/L,較對照組提高了8.63倍(圖1b)。其次,在接種T.versicolor的培養基中,松柏醇的誘導效果最為明顯,并在培養的第5d酶活達到峰值13.81U/L,較對照組提高了164.80倍(圖1a)。盡管藜蘆醇是報道最多的MnP誘導劑,但在本實驗中只對T.versicolor和P.ostreatus產MnP有一定誘導作用,其中對P.ostreatus的誘導效果最好,酶活達到峰值時為對照組的8.00倍(圖1b)。將四株菌的對照組酶活進行對比,結果顯示B.adusta產MnP能力比其它菌更強,酶活最高可達31.83U/L,且在4-甲氧基苯胺的誘導下,第5d酶活達130.125U/L,是所有芳香類物質誘導中出現的最高值(圖1d)。

圖1 不同芳香族化合物對四種白腐菌MnP活性的影響Fig.1 Effect of different aromatic compound on MnP activity of four white-rot fungus注：a：Trametes versicolor；b：Pleurotus ostreatus；c：Dichomitus squalens；d：Bjerkandera adusta。

結果表明,芳香族化合物對四種白腐菌產MnP的誘導效果較好。但隨著取代基的種類、數目和位置的不同,對于白腐菌產MnP活性的影響是有差異的。另外,由于菌種不同,芳香類物質對MnP活性的影響也存在顯著差異。

2.2 乙醇和異丙醇對MnP活性影響

醇類能增加白腐菌膜的滲透性,從而促進蛋白分泌。另外,醇類對白腐菌具有一定毒害作用,會刺激白腐菌分泌木質素降解酶來消除其毒害作用[16]。因此本實驗考察了乙醇和異丙醇對T.versicolor、P.ostreatus、D.squalens和B.adusta四種菌產MnP活性的影響。

圖2所示,在T.versicolor、P.ostreatus和D.squalens培養基中添加異丙醇后,MnP活性明顯增加,說明異丙醇對這三種菌具有較好的誘導作用(圖2a,b),其中對T.versicolor產MnP的誘導效果最好,在培養的第9d酶活達到峰值18.29 U/L,較對照組提高了9.97倍,均高于其它芳香族化合物對該菌的誘導酶活。相比之下,乙醇對T.versicolor、P.ostreatus和D.squalens三種菌產 MnP無明顯誘導現象,只有在培養的第5d對B.adusta產MnP有較好誘導作用,能使其最高酶活達85.06 U/L,但隨著培養天數增加,其酶活迅速下降,最終對該菌產MnP無誘導作用(圖2d)。

圖2 乙醇和異丙醇對四種白腐菌MnP活性的影響Fig.2 Effect of ethanol and isopropanol onMnP activity of four white-rot fungus注：a：Trametes versicolor；b：Pleurotus ostreatus；c：Dichomitus squalens；d：Bjerkandera adusta。

結果表明,相同濃度下,異丙醇對MnP的誘導效果優于乙醇,這或許是由于異丙醇的毒性大于乙醇,且在生物體內代謝慢,因此更易刺激白腐菌分泌MnP,從而導致MnP活性增加。但總體而言,醇類物質對MnP的誘導作用較芳香族化合物弱。

2.3 Cu2+和Mn2+對MnP活性影響

許多研究報道顯示[5,17],除芳香族化合物外,微量金屬離子能誘導MnP產量增加,尤其是 Mn2+和Cu2+。丁少軍等人[18]在研究云芝產酶影響條件時,發現添加適量Mn2+和Cu2+均能提高MnP活性。這是由于Mn2+是 MnP活性基團的組成部分,同時又作為MnP還原底物即電子供體,對MnP有激活作用[14]。Cu2+也被認為與MnP活性位點相結合,從而對MnP有激活作用。雖然國內外對Mn2+和Cu2+誘導作用研究較多,但只局限于部分真菌,由于不同真菌分子調控機理不同,因此該實驗考察了Mn2+和Cu2+對T.versicolor、P.ostreatus、D.squalens和B.adusta四種菌產MnP活性的影響。

圖3所示,兩種金屬離子整體上能顯著提高T.versicolor、D.squalens和B.adusta三種菌產MnP活性,但各自對不同菌產MnP的誘導能力不同。其中,Cu2+對T.versicolor和D.squalens兩種真菌菌株產MnP誘導效果最好(圖3a,c)。由圖可知,在培養的第13d,Cu2+可誘導T.versicolor產MnP活性達263.98U/L,較對照組提高了49.68倍,且仍呈上升趨勢；而Mn2+卻對該菌產MnP無明顯誘導現象(圖3a)。另外,D.squalens培養基添加Cu2+后,在第11d酶活達到峰值225.79 U/L,較對照組提高了63.90倍,且比芳香族化合物最佳誘導酶活(18.39U/L)高出了11.28倍；此外Mn2+在該菌培養9d后開始刺激了MnP產量,并在第13d使其酶活達106.29U/L,較對照組提高78.73倍(圖3c)。Mn2+對P.ostreatus和B.adusta產MnP的刺激效果也是不可忽視的,但其最佳誘導時間和誘導趨勢因菌種而異。例如,添加Mn2+后,P.ostreatus在培養的第9d酶活達到峰值7.92U/L(圖3b)；B.adusta在第5d酶活達最高值140.21U/L,但之后呈下降趨勢(圖3d)。

圖3 Cu2+和Mn2+對四種白腐菌MnP活性的影響Fig.3 Effect of Cu2+and Mn2+on MnP activity of four fungus注：a：Trametes versicolor；b：Pleurotus ostreatus；c：Dichomitus squalens；d：Bjerkandera adusta。

結果表明,Mn2+和Cu2+能誘導四種白腐菌大量產MnP,且總體上對MnP的誘導效果優于芳香族化合物,因此可對上述四種真菌中金屬離子是如何跨膜與MnP活性位點結合以及結合的具體位置進行進一步深入研究。

2.4 不同真菌菌絲間相互作用對MnP活性的影響

不同真菌菌絲間誘導主要是通過共培養的方式實現。該實驗將T.versicolorshi,P.ostreatus,D.squalens,B.adusta四株菌兩兩組合,分別進行共培養。

結果顯示T.versicolorshi、P.ostreatus和D.squalens三種菌兩兩共培養時MnP活性較單一菌株培養時均有不同程度地提高(圖4),表明這三種菌可能具有種間誘導能力。其中,T.versicolorshi和D.squalens共培養時MnP活性最高,達44.02U/L,較T.versicolorshi和D.squalens單一培養時的酶活0.77U/L和0.51U/L分別提高了56.17倍和85.31倍。而B.adusta分別與上述三種真菌兩兩共培養時MnP活性均沒有提高(圖中未顯示),這或許因為B.adusta不具有種間誘導能力。

圖4 不同真菌菌絲種間誘導對MnP酶活的影響Fig.4 Effect of different hyphal interspecific induction on MnP activity注：A:Trametes versicolor；B:Pleurotus ostreatus；C:Dichomitus squalens,D:Bjerkandera adusta。

早前一些研究者也嘗試通過真菌共培養方法來增加真菌分泌的MnP產量。例如,Chi Y等人[19]發現Pleurotus.ostreatus與Ceriporiopsis.subvermispora以及Pleurotus.ostreatus與Physisporinus.rivulosus進行共培養時,其MnP活性比各自單一培養時高,并推測是由于不同真菌對于空間和營養的競爭會導致木質素的降解增強,同時也提高了木質素降解酶(包括MnP)的產量。目前關于真菌間相互作用研究較少,因此其MnP種間誘導的分子機理還需進一步研究。

3 結論

不同外源誘導物對不同白腐菌產MnP的誘導效果不同。對比T.versicolor、P.ostreatus、D.squalens和B.adusta四種菌MnP誘導后的活性,結果表明,T.versicolor、D.squalens、B.adusta三種菌的MnP更具外源誘導物誘導潛力,并且微量金屬離子Mn2+和Cu2+對MnP的誘導作用大于芳香族化合物和醇類物質,能顯著增加MnP產量。不同真菌相互作用時,T.versicolor,P.ostreatus和D.squalens三種菌兩兩組合共培養的MnP活性較單一培養時均有明顯增加,因此推測這三種白腐菌可能具有種間誘導潛力。

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Induction on the Manganese Peroxidase of white-rot fungi by exogenous inducers and interspecific induction

ZHONG Zi-xuan,LIU Li,ZHANG Yong,LUO Feng*

(College of Resource and Environment,Southwest University,Chongqing Key Laboratory of bio-energy resource developement,Chongqing 400716,China)

The study investigated the MnP activity ofTrametesversicolor,Pleurotusostreatus,Dichomitussqualens,Bjerkanderaadustaby two kinds of induction,exogenous inducer and interspecific induction between different fungi,and discovered that in some induction condition,these white-rot fungi could produce large amounts of MnP. The results showed that in exogenous inducers,2,5-dimethylaniline was an effective MnP inducer,which could enhance MnP activity of four fungi to different extent. Isopropyl alcohol could enhance MnP activity ofT.versicolor,P.ostreatusandD.squalens,and it was better than that of ethanol. Cu2+could significantly enhance MnP activity ofT.versicolorandD.squalens. Mn2+could significantly enhance MnP activity ofP.ostreatusandB.adusta. When induced by interspecific induction between different fungi by co-cultivation,T.versicolor,P.ostreatusandD.squalensscould strongly enhance MnP activity each other. The study provided possibility for large production of MnP and being applied to industry.

white-rot fungi;Manganese Peroxidase;exogenous inducer;interspecific induction

2014-07-14

鐘紫旋(1991-)，女，研究生，研究方向：生物能源與環境修復。

*通訊作者:羅鋒(1977-)，男，博士，教授，研究方向：生物能源與環境修復。

國家外專干人計劃活動專項(2012SWU112097)；中央高校基本科研重點項目(XDJK2011B009)資助項目。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.028