解淀粉芽孢桿菌胞外多糖發酵條件的優化

張麗姣,曾 艷,張 穎,宋 詼,賈士儒,孫媛霞,*

(1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457;2.中國科學院天津工業生物技術研究所,天津 300308)

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解淀粉芽孢桿菌胞外多糖發酵條件的優化

張麗姣1,2,曾 艷2,張 穎2,宋 詼2,賈士儒1,孫媛霞2,*

(1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457;2.中國科學院天津工業生物技術研究所,天津 300308)

解淀粉芽孢桿菌PB6可以生產胞外多糖,通過單因素和響應面實驗,對其進行發酵優化研究。實驗結果表明,最優發酵培養基:蔗糖濃度400g/L、酵母粉2.5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0;發酵條件為:接種量4%、溫度30℃、轉速150r/min、發酵時間26h。在此條件下發酵的解淀粉芽孢桿菌胞外多糖的產量可高達104.37g/L。

解淀粉芽孢桿菌,胞外多糖,響應面法,發酵優化

基于其安全優良的理化性能,以及產糖周期短、自然因素干擾小、產品容易分離的生產優勢,微生物多糖在工業上受到日益重視,已作為穩定劑、膠凝劑、成膜劑、乳化劑等被廣泛應用于食品、石油、制藥、化妝品等領域。目前市售微生物多糖包括黃原膠、結冷膠、短梗霉多糖等[1-4]。近年來微生物多糖生產的研究熱點主要集中在篩選產多糖的安全優良菌種與發酵條件優化提高多糖產率上。

解淀粉芽孢桿菌屬于公認安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)菌株[5],不同來源的解淀粉芽孢桿菌產生的胞外多糖(EPS)具有不同的理化性質和生物活性。如來源于解淀粉芽孢桿菌LPL061的EPS具有良好的流變性、乳化性和熱穩定性,還能進行免疫調節[6];來源于冬麥的解淀粉芽孢桿菌分泌的EPS能夠抑制胃癌細胞MC-4和SGC-7901生長活性[7],由此可見解淀粉芽孢桿菌胞外多糖在食品、醫藥行業具有廣闊的應用前景。然而,較低的產量會限制解淀粉芽孢桿菌多糖的潛在應用發展。如李彥巖對解淀粉芽孢桿菌LPL061進行發酵優化后多糖產量僅為4.46g/L[8];張紅霞對產果聚糖的Cellulomonassp. GJT07進行發酵優化后多糖產量為15g/L[9]。因此,在開發解淀粉芽孢桿菌多糖新功能的同時,如何優化其生產條件提高產量也備受關注。

為進一步促進解淀粉芽孢桿菌胞外多糖的深入研究與工業生產開發,針對本實驗室獲得的一株能夠分泌多糖的解淀粉芽孢桿菌PB6,先通過單因素實驗選取實驗因素與水平,再運用響應面分析方法(Response Surface Analysis,RSA)對PB6產胞外多糖發酵條件進行優化,以期提高PB6的多糖產量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌PB6由中科院天津工業生物技術研究所工業酶重點實驗室篩選。

種子培養基:胰蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,NaCl 10g/L;基礎培養基:葡萄糖20g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、ddH2O 1L,115℃滅 20min;其他試劑均為國產分析純。

UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司;IS-RDD3臺式恒溫振蕩器 河南兄弟儀器設備有限公司;FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;D-37520離心機 美國Thermo公司;IKA RV10旋轉蒸發儀、IKA HB10數顯/控制加熱鍋 德國IKA集團/艾卡(廣州)儀器設備有限公司;SHZ-D(Ⅱ)循環水式真空泵 河南省予華儀器有限公司;FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 菌種活化:取-80℃低溫保存的菌種,解凍后取20μL菌液接種于5mL液體LB培養基試管中,37℃、200r/min活化12h,再以1%的接種量接種于種子培養基,37℃恒溫培養箱培養9h,作為發酵種子液。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌PB6的EPS提取 PB6菌株發酵液經8500r/min離心15min,去除菌體與雜質,上清液中加入3倍體積無水乙醇,4℃過夜沉淀,離心除上清,沉淀復溶后,去離子水透析3d,每隔8h換水,收集透析液,將透析液定容至一定體積,備用。

1.2.3 胞外多糖含量的測定 以葡萄糖為標品,采用苯酚-硫酸法[10]測定1.2.2所得的透析液中多糖含量。

1.2.4 解淀粉芽孢桿菌PB6產EPS單因素實驗設計

1.2.4.1 碳源種類及濃度對EPS產量的影響 分別以20g/L的蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖、木糖替代基礎培養基中的葡萄糖,其他成分不變,以蔗糖為對照。以2%的接種量于37℃、200r/min條件下培養24h,以EPS產量為指標,確定最適碳源。以200、250、300、350、400、450、500g/L的濃度添加蔗糖到LB液體培養基,作為發酵培養基,其余發酵條件同上,以EPS產量為指標,確定最適蔗糖濃度。

1.2.4.2 氮源種類及濃度對EPS產量的影響 分別以10g/L的牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、檸檬酸三銨替代基礎培養基中的胰蛋白胨,蔗糖400g/L,NaCl 10g/L,以胰蛋白胨為對照。發酵條件同上,并測定EPS產量,確定最適氮源。以1.25、2.5、5、7.5、10g/L的濃度添加酵母粉,蔗糖400g/L,NaCl 10g/L,作為發酵培養基,其他同樣條件發酵,測定EPS產量,以確定最適酵母粉濃度。

1.2.4.3 無機鹽種類對EPS產量的影響 分別以10g/L的MgCl2、MgSO4、CaCl2、MnSO4、K2HPO4,代替基礎培養基中的NaCl,蔗糖400g/L,酵母粉2.5g/L,以NaCl為對照。發酵條件同上,測定EPS產量,以確定最適無機鹽種類。

1.2.4.4 pH、接種量、溫度、轉速及發酵時長對EPS產量的影響 選用優化后的產糖培養基進行發酵條件優化。在接種量2%、溫度37℃、轉速200r/min的條件下培養24h,測定發酵培養基不同初始pH(5、6、7、8、9)對EPS產量的影響。在培養基初始pH為7、溫度37℃、轉速200r/min的條件下培養24h,測定接種量(1、2、3、4、5、6%)對EPS產量的影響。在培養基初始pH7、接種量4%、轉速200r/min的條件下培養24 h,測定發酵溫度(25、30、35、40℃)對EPS產量的影響。在培養基初始pH為7、接種量4%、溫度30℃的條件下培養24h,測定轉速(100、150、200、250r/min)對EPS產量的影響。在pH7、接種量4%、溫度30℃、轉速150r/min的條件下培養,測定發酵時長(12、24、36、48、60、72h)對EPS產量的影響。

1.2.5 Box-Behnken響應面設計 在單因素實驗的基礎上,選擇對EPS產量影響較大的蔗糖濃度、發酵溫度和發酵時長3個因素為自變量,以EPS產量為響應值,應用Box-Behnken中心組合實驗和響應面分析法設計3因素3水平實驗方案,因子編碼及水平設計見表1[11-12]。

表1 響應面實驗因素水平表Table1 The factors and levels of the response surface experiment

1.2.6 驗證實驗 響應面實驗分析獲得PB6產胞外多糖最優發酵工藝,以最優條件進行3次重復發酵實驗,以驗證模型的可靠性。

2 結果與分析

2.1 培養基成分對EPS產量的影響

2.1.1 碳源種類及碳源添加量對EPS產量的影響 碳源作為細胞生長最重要的能量與營養來源,對芽孢桿菌EPS產量影響顯著,由圖1a可知PB6能利用多種碳源產生EPS,以蔗糖為碳源時EPS產量最高,因此選擇蔗糖做為碳源進行下一步探究。據報道,解淀粉芽抱桿菌具有較高的果聚糖蔗糖酶(Levansucrases)活性,該酶是果糖基轉移酶,能夠催化轉移非活性蔗糖的果糖殘基到果聚糖鏈上[13],因此,以蔗糖為碳源時,菌株PB6的EPS產量較高。由圖1b可知隨著蔗糖濃度的增加,PB6多糖產量也增加,蔗糖400g/L時,多糖產量最高,隨后蔗糖濃度繼續增大,EPS合成反而受到影響。

圖1 碳源種類及濃度對EPS產量的影響Fig.1 Effect of carbon source type and concentration on EPS yield

2.1.2 氮源種類及氮源添加量對EPS產量的影響 氮源主要通過影響微生物的生長速率影響EPS等次級代謝產物的合成。本實驗選擇有機氮源和無機氮源進行優化,由圖2a可知,菌株PB6能夠利用有機氮源生產多糖,以無機氮源為唯一氮源時多糖產量極低。在4種供試有機氮源中,以酵母粉為氮源時EPS產量最高,所以選擇酵母粉作為氮源進行進一步優化。由圖2b可知隨著酵母粉濃度的增加,PB6多糖產量也增加,酵母粉用量為2.5g/L時,多糖產量最高,隨后濃度繼續增大,營養成分主要用于菌體生長,EPS合成受到影響。故選擇酵母粉濃度2.5g/L做為最適氮源濃度。

圖2 氮源種類及濃度對EPS產量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type and concentration on EPS yield

2.1.3 無機鹽種類對EPS產量的影響 參照LB培養基,以添加10g/L氯化鈉的培養基作為對照組,測定無機鹽對多糖產量的影響,結果如圖3所示。相較于氯化鈉組別,其他無機鹽的添加并沒有提高EPS產量,某些無機鹽如硫酸錳甚至對菌株有明顯的毒害作用。酵母粉中存在某些生長因子能滿足營養需求,添加的無機鹽離子對產糖量影響不大。因此在確定最適培養基配方時,不再考慮無機鹽種類,只添加10g/L的氯化鈉調節細胞滲透壓。

圖3 無機鹽種類對EPS產量的影響Fig.3 Effect of inorganic salt type on EPS yield

2.2 培養條件對EPS產量的影響

2.2.1 培養基初始pH對EPS產量的影響 通過影響菌體的細胞膜形態以及營養物質的離子化程度,pH能改變微生物的相關酶活性與菌體代謝途徑。因此,培養基過酸或過堿都會導致細胞代謝變差甚至死亡。由圖4可知,菌株PB6在pH5～9范圍內均能產多糖,pH為7時,最適合EPS的合成。故選擇pH7作為PB6最適發酵初始pH。

圖4 初始pH對EPS產量的影響Fig.4 Effect of initial pH on EPS yield

2.2.2 接種量對EPS產量的影響 接種量直接影響發酵液內的最初活菌數,從而影響菌體的生長以及EPS的生物合成量。如圖5所示,EPS產量隨著接種量增大而增加,當接種量4%時多糖產量最高,隨后接種量繼續增大EPS產量反而降低,原因是接種量過高,營養物質主要用于菌體生長,使得EPS的合成受到限制,從而產量降低。故選擇4%作為PB6最適發酵接種量,這一結果與蹇華麗等[14]的報道一致。

圖5 接種量對EPS產量的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on EPS yield

2.2.3 發酵溫度對EPS產量的影響 溫度是對微生物生長繁殖和新陳代謝影響最為明顯的因素。不同微生物生長繁殖所需的最適溫度不同,同一種微生物產生不同代謝產物所需的溫度也不盡相同[15]。不同發酵溫度下EPS產量見圖6,30℃時明顯較其他溫度時產量高,推測可能是因為溫度升高或降低會影響菌體內酶的活力,從而對菌種的生長繁殖和代謝產物的積累產生影響,故選擇30℃作為PB6的最適發酵溫度。

圖6 發酵溫度對EPS產量的影響Fig.6 Effect of culture temperature on EPS yield

2.2.4 轉速對EPS產量的影響 解淀粉芽孢桿菌是好氧菌,氧氣量對細菌生長與繁殖有較大影響,氧氣量與轉速有關。不同轉速對EPS產量影響如圖7所示,搖床轉速為150r/min時,EPS產量最高。轉速過低時,氧氣量不充足,生長代謝受到抑制,產糖量較低;當轉速大于150r/min時,營養物質主要用于菌體增殖,產糖量降低。故選擇150r/min作為PB6的最適發酵轉速。

圖7 發酵轉速對EPS產量的影響Fig.7 Effect of fermentation speed on EPS yield

2.2.5 發酵時長對EPS產量的影響 不同發酵時間對EPS產量的影響見圖8,隨著發酵時間的延長,EPS產量迅速增加,在24h左右達到最高,之后24～48h EPS產量變化不大,可能發酵達到平衡,之后再延長發酵時間EPS產量開始降低,這可能是延長發酵時長會導致EPS被酶降解的緣故[16]。故選擇24h作為PB6的最適發酵時長。

圖8 發酵時長對產量的影響Fig.8 Effect of culture time on EPS yield

2.3 響應面分析法優化解淀粉芽孢桿菌EPS發酵條件

2.3.1 響應面實驗結果 根據Box-Bohnken實驗設計進行三因素三水平的響應面分析實驗,實驗設計及結果見表2,共17個實驗點,其中12個析因點,5個零點。

表2 響應面實驗設計及結果Table2 Experiment design and result of response surface method

2.3.2 響應曲面方差分析 響應面實驗中對多糖產量進行擬和的二次模型方差分析見表3。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table3 Analysis of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

注:*：差異顯著(p<0.05),**：差異極顯著(p<0.01)。

2.3.3 響應面分析及最優培養條件的確定 根據響應面圖可以直觀、高效地找到最佳參數、各參數之間的相互作用和最大響應值。從響應面方程所得響應面圖與等高線圖如圖9所示。

圖9 兩因素交互影響的響應面圖Fig.9 Response surface of the combined effects of sucrose concentration,culture temperature and time on EPS yield

由圖可知發酵溫度對EPS產量影響最大,表現為曲面最陡,發酵時長與蔗糖濃度對EPS產量也有顯著性影響,但曲面較平。這與回歸方程的計算值是完全一致的。利用Design Expert 8.0進行優化分析,得出菌株PB6產EPS最佳條件為:蔗糖濃度406.7g/L、發酵溫度30.7℃、發酵時長25.6h,在此條件下理論預測最大值為108.11g/L。為便于實際操作,將以上條件修正為:蔗糖濃度400g/L、溫度30℃、發酵時長26h。采取修正后的優化條件進行PB6發酵的驗證實驗,測得EPS產量為104.37g/L,達到預測值的96.54%,可見該模型具有較好的預測性和實用性。PB6菌株胞外多糖產量在目前所報道的數據中處于前列,具有工業化應用潛力,但是目前培養基中高濃度的蔗糖使得培養基成本較高,需要進一步尋求糖蜜、工農業廢料等更為廉價且發酵效果良好的培養基[17-19]。

3 結論

通過單因素實驗及響應面實驗對解淀粉芽孢桿菌PB6產胞外多糖發酵條件進行研究,得出最佳發酵條件為:蔗糖400g/L、酵母粉2.5g/L、NaCl 10g/L、初始pH7、接種量4%、發酵溫度30℃、發酵轉速150r/min、發酵周期26h,在此條件下多糖產量可達到104.37g/L,經檢測證明該模型是可靠的。

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Optimization of fermentation conditions for production of exopolysaccharide byBacillusamyloliquefaciensPB6

ZHANG Li-jiao1,2,ZENG Yan2,ZHANG Ying2,SONG Hui2,JIA Shi-ru1,SUN Yuan-xia2,*

(1.College of Biology Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China)

For the production of exopolysaccharide(EPS)fromBacillusamyloliquefaciensPB6,single-factor test and response surface methodology(RSM)were adopted to optimize the fermentation conditions. The results showed that the optimal medium components were consisted of 400g/L sucrose,2.5g/L yeast extract and 10g/L NaCl at an initial pH of 7. The optimal fermentation conditions were 4% inoculum amount,culture temperature of 30℃,shaking speed of 150r/min and incubation time of 26h. Under the optimized conditions,a maximum EPS yield of 104.37/L was achieved.

Bacillusamyloliquefaciens;exopolysaccharide;response surface methodology;fermentation condition optimization

2014-08-11

張麗姣(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物多糖生產與功能研究。

*通訊作者:孫媛霞(1963-)，女，博士，研究員，研究方向：功能糖與天然活性物質。

國家高技術研究發展計劃(863計劃)項目(2012AA021403)；中國科學院重點部署項目(KSZD-EW-Z-019)。

TS201.3

B

:1002-0306(2015)09-0214-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.038