加壓毛細管電色譜法同時測定植物油中4種抗氧化劑

王曉曦,王 彥,李 靜,茹 鑫,閆 超,*

(1.上海交通大學藥學院,上海 200240;2.上海通微分析技術有限公司,上海 201203)

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加壓毛細管電色譜法同時測定植物油中4種抗氧化劑

王曉曦1,王 彥1,李 靜2,茹 鑫2,閆 超1,*

(1.上海交通大學藥學院,上海 200240;2.上海通微分析技術有限公司,上海 201203)

采用加壓毛細管電色譜-紫外檢測,建立了一種適用于植物油中常見抗氧化劑的分離檢測方法。使用1.8μm粒徑的C18毛細管色譜柱,以乙腈-水(0.05%甲酸)為流動相進行梯度洗脫,泵流速為0.05mL/min,分流比為1∶200,分離電壓為15kV,沒食子酸丙酯(PG)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)四種抗氧化劑可在8min內實現快速分離。各組分的檢出限(S/N=3)分別為0.6、2.0、3.0、5.5μg/mL,線性關系良好,樣品加標回收率在93.5%～108.0%之間,RSD在0.3%～1.3%之間。將所建立方法應用于植物油樣品的分析,取得了良好的分析結果。

加壓毛細管電色譜,pCEC,紫外檢測,抗氧化劑,植物油

沒食子酸丙酯(PG)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、丁基化羥基茴香醚(BHA)和2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)是常用的人工合成酚類抗氧化劑,常添加在含油脂的食品中。但研究表明,人工合成抗氧化劑的過量食用具有諸多副作用,如對肝、脾、肺等器官的損傷[1]。我國在國標GB2760-2011“食品添加劑使用標準”中對其使用量進行了嚴格的規定[2]。

食品中的抗氧化劑分析由于存在基質復雜,含量低等特點,一直受到關注。目前常規抗氧化劑的分析方法有氣相色譜法[3-8]、膠束毛細管色譜法[9]和高效液相色譜法[10-16]。其中氣相色譜法需要嚴格且復雜的樣品前處理過程,而常規的液相色譜法分離時間較長,試劑樣品耗費多。因此有必要發展一種更為簡便、快速、經濟的抗氧化劑檢測方法。

加壓毛細管電色譜(pressurized capillary electrochromatography,pCEC)是近年發展起來的一種新興微分離技術,具有高柱效、高選擇性、高分辨度、快速分離的特點,且其樣品和試劑消耗少。利用電滲流和壓力流雙重驅動力,由于在流動相和固定相中分配系數的不同以及電泳淌度的差異,樣品被快速、高效的分離。pCEC已廣泛應用于農獸藥殘留分析[17-18]、環境激素分析[19]、藥物分析[20-21]、食品安全檢測[22-23]、代謝組學[24-25]、生命科學[26-27]等研究領域。目前,基于pCEC分離平臺分析抗氧化劑的方法,在國內外未見此類文獻報道。

本研究基于pCEC微分離平臺,建立了同時檢測植物油中四種抗氧化劑的加壓毛細管電色譜法(pCEC-UV),該方法簡單快速,準確可靠,為抗氧化劑的分離檢測提供了新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙腈 色譜純,美國TEDIA公司;甲醇 色譜純,上海國藥集團化學試劑有限公司;甲酸、鹽酸、三乙胺、醋酸銨 分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司;三氟乙酸 分析純,上海安譜科學儀器有限公司;沒食子酸丙酯、叔丁基對苯二酚、丁基羥基茴香醚 純度>98%,阿拉丁;2,6-二叔丁基對甲酚 純度>99.0%,阿拉丁;大豆油(標注添加叔丁基對苯二酚)、菜籽油(標注添加叔丁基對苯二酚)、葵花油、橄欖油 購自超市;水 二次蒸餾水。

TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜儀 Unimicro Technologies,Inc.,Pleasanton,CA,USA;毛細管液相色譜柱 150mm×100μm i.d.,1.8μm,蘇州環球色譜有限公司;PB-10 pH計 北京賽多利斯儀器有限公司;FA1004電子天平 上海恒平科學儀器有限公司;AS5150A 超聲波清洗機 天津奧特賽思斯儀器有限公司;HP-01無油真空泵 天津恒奧科技發展有限公司;TGL-16G離心機 上海安亭科學儀器廠;氮吹儀 上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 標準溶液的配制

4種抗氧化劑標準儲備液的配制:分別準確稱取沒食子酸丙酯、叔丁基對苯二酚、丁基羥基茴香醚、2,6-二叔丁基對甲酚各25mg,置于燒杯中,用適量乙腈溶解,分別移入25mL棕色容量瓶中,以乙腈定容至刻度,制成1mg/mL的標準貯備液,低溫保存。

4種抗氧化劑系列標準工作溶液的配制:用乙腈溶液將上述標準儲備液逐級稀釋為2、5、10、50、100、200μg/mL的系列標準混合溶液,置于冰箱保存備用。

1.3 樣品前處理

準確稱取大豆油5g(精確至0.001g),置于具塞離心管中,加入8mL甲醇,漩渦混合3min,靜置2min,以3000r/min離心5min,用微量移液器取出上清液,殘余物每次用8mL甲醇提取2次,合并上清液與甲醇提取液,用氮吹儀于50℃下濃縮至近干,以適量甲醇溶解并定容至5mL容量瓶。

1.4 pCEC-UV 色譜條件

色譜柱:C18毛細管電色譜柱(Global EP,150mm×100μm i.d.,1.8μm,蘇州環球色譜有限公司);流動相:A相:10%乙腈(含0.05%甲酸,pH3.2),B相:95%乙腈(含0.05%甲酸,pH3.2);總流速:0.05mL/min;檢測波長:280nm;進樣量:5nL(分流比:1∶200)

表1 4種抗氧化劑的洗脫梯度Table1 Gradient elution program for four antioxidants

2 結果與討論

2.1 pCEC-UV色譜條件的選擇與優化

本研究基于加壓毛細管電色譜平臺,實驗中主要考察了流動相組成、緩沖液、pH、分離電壓等色譜條件對4種抗氧化劑分離的影響,并進行了條件優化。

2.1.1 流動相中強洗脫劑的選擇 實驗中分別考察了甲醇、乙腈作為常用流動相對樣品分離的影響。實驗結果表明甲醇-水和乙腈-水都可以將抗氧化劑有效分開,相比之下乙腈的洗脫能力強,可以顯著提高分析速度,改善峰型。且在pCEC中,施加電壓時,乙腈利于電滲流的產生。故本實驗最終確定以乙腈-水作為流動相進行梯度洗脫。

2.1.2 酸性改性劑種類和濃度 加壓毛細管電色譜分離體系中需要添加可導電的酸、堿或者緩沖鹽溶液,以保證施加電壓后形成穩定的電場及電滲流[28],實驗中分別考察了三氟乙酸、甲酸以及醋酸銨改性劑等對分離的影響。結果表明,三氟乙酸以及醋酸銨緩沖溶液體系下,色譜峰的響應值變低,且加電后的電流值過高,容易引起焦耳熱效應[29],造成基線噪聲較大;而添加甲酸后,可有效改善色譜峰形,減少拖尾,在施加電場后,電流穩定,基線平穩。同時注意到,添加過量的甲酸會造成流動相體系的pH過低,不利于電滲流的產生,所以本實驗最終選擇甲酸的濃度為0.05%(pH3.2)。

2.1.3 pH的選擇與優化 pH的變化會影響電滲流的大小,從而影響樣品的分離度和分析速度。C18毛細管色譜柱適用的pH范圍在2～8之間,在甲酸緩沖體系下,調節pH,發現隨著pH的增加電滲流會相應變大,但沒食子酸丙酯色譜峰的拖尾現象也越發嚴重,故本實驗在確保合適的電滲流以及良好的峰型條件下最后選擇的pH為3.2。

2.1.4 分離電壓的影響 電壓是pCEC實驗條件中的一個重要參數,施加不同的電壓對樣品的分析速度和分離度產生影響。實驗中分別考察了電壓為0、5、10、15、20kV時,4種抗氧化劑的分離情況。

實驗過程中發現,隨著施加電壓的增加,電流值會逐漸增大。當施加電壓達到20kV時,電流值會快速上升并產生明顯的焦耳熱效應。由圖1可見,當分離電壓達到20kV后,由于焦耳熱效應使得基線波動增大,影響抗氧化劑的定量測定。

圖1 抗氧化劑在20kV電壓下的色譜圖Fig.1 Effect of applied voltage of 20kV on pCEC separation of four antioxidants注:1.沒食子酸丙酯;2.叔丁基對苯二酚;3.丁基羥基茴香醚;4.2,6-二叔丁基對甲酚，圖2、圖3同。

同時,由圖2可見,由于電滲流方向和壓力流方向一致,且隨施加電壓的增加一直呈增大趨勢,整體的分析速度有所提高。實驗中還發現丁基羥基茴香醚對照品存在雜質干擾,在不加電的情況下兩者分離度較差,影響丁基羥基茴香醚的定量測定,但隨著分離電壓的增加,二者的分離度逐漸增大(見表2)。綜合各方面因素,本實驗最終選擇15kV作為分離電壓。

圖2 抗氧化劑在不同電壓下的色譜圖Fig.2 Effect of applied voltage on pCEC separation of four antioxidants

表2 不同電壓下丁基羥基茴香醚和雜質的分離度 Table2 Resolution of BHA and impurities at different voltages

最后在優化pCEC-UV色譜條件下,得到4種抗氧化劑的分離色譜圖,如圖3所示。

圖3 4種抗氧化劑對照品的pCEC色譜圖Fig.3 pCEC electrochromatogram of four antioxidants

2.2 分析方法學驗證

2.2.1 精密度 取標準品混合液,按照1.4節的實驗條件連續進樣6次,計算各色譜峰保留時間和峰面積的相對標準偏差,結果見表3。其中,保留時間RSD均小于1%,峰面積RSD均小于2%,表明方法精密度良好。

表3 4種抗氧化劑的保留時間、峰面積、及其相對標準偏差(n=6)Table3 Migration time,peak area and their relative standard deviations(RSD)of four antioxidants(n=6)

2.2.2 線性范圍和檢出限 以1.2節配制的系列標準溶液按照本實驗方法進行測定,以4種抗氧化劑的色譜峰面積(Y)與其對應的質量濃度(X,μg/mL)進行線性回歸,以信噪比S/N=10計算定量限,S/N=3計算檢出限,結果見表4。4種抗氧化劑的線性關系良好,線性相關系數均大于0.999。

表4 4種抗氧化劑的線性方程、線性相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Table4 Regression equation,correlation coefficients(r),linear ranges,limits of detection(LOD,S/N=3)and limits of quantitation(LOQ,S/N=10)of four antioxidants

2.2.3 加標回收率 取大豆油樣品5g,在線性范圍內,添加3個不同水平的抗氧化劑標準品,按照1.3節的樣品前處理方法進行處理后進行pCEC分析,每個樣品連續進樣3次,結果見表5。該方法加標回收率在93.5%～108.0%之間,RSD在之間0.3%～1.3%之間,表明本方法具有良好的準確性和精密度。

表5 大豆油中4種抗氧化劑的加標量、回收率及其相對標準偏差(n=3)Table5 Recoveries and relative standard deviations(RSD)of four antioxidants in soybean oil(n=3)

2.3 實際樣品測定

準確稱取某品牌大豆油5g,按照1.3節的樣品前處理方法進行處理后,并按照1.4節的pCEC色譜條件進行分析,分析結果如圖4所示,該品牌大豆油中僅檢出叔丁基對苯二酚一種抗氧化劑,含量為47.6μg/g。

圖4 大豆油樣品中叔丁基對苯二酚的pCEC色譜圖Fig.4 pCEC electrochromatogram of TBHQ in soybean oil注:1 叔丁基對苯二酚。

為了考察本實驗方法的適用性和準確性,分別測定了4個不同廠家的4種植物油(表6),檢測結果表明與各產品標示添加的情況相符合。

3 結論

本文以加壓毛細管電色譜法(pCEC)為平臺,在8min內可以完成4種抗氧化劑的同時測定。該方法簡單快速,準確可靠,借助pCEC電滲流和壓力流的雙重推動力,能將丁基羥基茴香醚中的雜質與主成分分開,提高了分析速度和分離效能。pCEC 作為一種微分離技術,實際分析流速只在微升級甚至納升級,且樣品用量只有幾納升,大大節省了檢測成本,具有實用推廣價值。

表6 不同植物油中4種抗氧化劑的含量Table6 The determination of four antioxidants in different kinds of vegeTableoils

注:ND表示未檢出。

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Determination of four antioxidants in vegeTableoils by pressurized capillary electrochromatography

WANG Xiao-xi1,WANG Yan1,LI Jing2,RU Xin2,YAN Chao1,*

(1.Pharmacy School,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China;2.Unimicro Technologies,Inc.,Shanghai 201203,China)

A method for antioxidants analysis in vegeTableoils was developed by using pressurized capillary electrochromatography(pCEC)with UV/Vis detection. The separations were performed on a C18capillary column packed with 1.8μm particles. The mobile phase was acetonitrile/water containing 0.05% formic acid(pH3.2)at a pump flow rate of 0.05mL/min with splitting ratio of 1∶200 and the separation voltage was 15kV. Four antioxidants(PG,TBHQ,BHA,BHT)were baseline separated within 8min in gradient elution mode. The detection limits of each antioxidant(S/N=3)were 0.6,2.0,3.0,5.5μg/mL respectively with good linear correlation. The method was applied to detect the regeTableoils and the results was accurate. The spiked recoveries of vegeTableoils were 93.5%～108.0%,with RSD ranged 0.3%～1.3%.

pressurized capillary electrochromatography;pCEC;ultra-violet(UV)detection;antioxidants;vegeTableoils

2014-08-05

王曉曦(1987-),女,碩士研究生,研究方向:加壓毛細管電色譜在食品安全中的應用。

*通訊作者:閆超(1956-),男,博士,教授,研究方向:電色譜。

國家自然科學基金項目(21175092,21105064)。

TS207.3

A

:1002-0306(2015)09-0273-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.051