創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞變化及調(diào)節(jié)措施研究進展

馬曉媛，靳 賀，梁華平

嚴重創(chuàng)傷/燒傷可致機體各器官和組織發(fā)生一系列病理生理改變，其病理機制涉及神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡以及凝血、纖溶、血管內(nèi)皮細胞系統(tǒng)等。單核－巨噬細胞是介導體內(nèi)炎癥反應的主要效應細胞之一，在損傷相關模式識別分子及病原體相關模式識別分子的刺激下可迅速產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，啟動全身炎癥反應綜合征(SIRS)、代償性抗炎反應綜合征(CARS)或混合拮抗反應綜合征(MARS)的級聯(lián)反應病理過程，最終導致機體的免疫功能紊亂及多器官功能的損害。深入研究嚴重創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞的變化規(guī)律，闡明其變化的分子機制，提出相應的免疫調(diào)節(jié)措施則可為臨床創(chuàng)傷/燒傷患者的救治提供新的策略。本文就近年來單核－巨噬細胞在創(chuàng)傷/燒傷領域中的相關研究進展作一簡要概述。

1 嚴重創(chuàng)傷/燒傷后單核－巨噬細胞數(shù)量及功能的改變

眾所周知，機體遭受創(chuàng)傷/燒傷后，先后有中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞侵潤到傷口(道)或創(chuàng)面部位，清除創(chuàng)傷局部的壞死組織、細胞碎片及污染的病原微生物，并參與創(chuàng)面愈合和組織修復過程。近年來大量研究證實，創(chuàng)傷/燒傷后可致機體全身的單核－巨噬細胞的數(shù)量和功能發(fā)生改變，進而介導傷后的免疫功能紊亂及多器官的炎性損害進程。

1.1 嚴重創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞亞群及數(shù)量變化Noel等［1］報道了熱力損傷能增加骨髓、脾臟及外周血中炎性單核細胞的數(shù)量。Howell等［2］在研究中發(fā)現(xiàn)燒傷后粒細胞單核細胞前體細胞(GMPs)中升高的巨噬細胞活化因子家族轉(zhuǎn)錄活化因子B(MafB)可通過下調(diào)紅系特異核蛋白轉(zhuǎn)錄因子(GATA-1)及上調(diào)巨噬細胞集落刺激因子受體(M-CSFRs)的表達量，進而抑制單核細胞分化為樹突狀細胞，但可促進其分化為巨噬細胞。也有學者發(fā)現(xiàn)，嚴重創(chuàng)傷患者單核細胞白細胞分化抗原(CD14highCD16+)亞群明顯擴增，該亞群單核細胞可產(chǎn)生抗炎細胞因子，與創(chuàng)傷后的免疫抑制狀態(tài)相關［3］。

1.2 嚴重創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞功能變化 嚴重創(chuàng)傷/燒傷不僅可致單核－巨噬細胞的吞噬、殺菌功能降低，抗原遞呈功能減弱，還可改變其活化狀態(tài)、表面抗原的表達、分泌功能及相關蛋白酶水平。Lopez等［4］發(fā)現(xiàn)，從燒傷小鼠體內(nèi)分離出的腹腔巨噬細胞對脂多糖(LPS)的刺激呈現(xiàn)高應答狀態(tài)，提示燒傷可誘導巨噬細胞的活化。Oh等［5］在氫氧化鈉(NaOH)制備燒傷小鼠眼模型中發(fā)現(xiàn)巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)在眼表面表達量高于正常水平，而MIF可刺激巨噬細胞的活化，通過促進環(huán)氧酶(Cox-2)，抑制p53通路以阻止巨噬細胞因失活而導致的凋亡，從而維持機體的炎性反應。然而在創(chuàng)傷后期特別是創(chuàng)傷后膿毒癥階段單核細胞則發(fā)生失活，且該變化與創(chuàng)傷后膿毒癥患者的高死亡率相關［6］。

無論是創(chuàng)傷還是燒傷均可致單-巨噬細胞表面人白細胞抗原(HLA-DR)的表達量降低［2］，其下降程度和持續(xù)時間與損傷嚴重程度密切相關。Yang等［6］進一步發(fā)現(xiàn)，燒傷患者外周血中CD14+單核細胞表面HLA-DR的表達明顯低于正常人，且與其第1、7、28天后分泌的IL-10呈負相關。有學者發(fā)現(xiàn)燒傷后24h單核細胞表面CD47表達持續(xù)下降，并且CD47的低表達與燒傷后早期嚴重程度有關［7］。由于CD47在單核細胞及其分化出的樹突細胞中均扮演了死亡受體的角色，故認為燒傷患者CD47的低表達可增加單核細胞的數(shù)量及單核細胞表面CD14表達量。Toll樣受體是參與機體免疫應答的一類重要跨膜分子，研究發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞表面Toll樣受體(TLR4)在小鼠胸部鈍性傷48h后表達量顯著增高，TLR4的啟動可以防御機體在創(chuàng)傷后感染某些革蘭陰性菌［8］。

嚴重熱力損傷也可導致巨噬細胞的分泌功能發(fā)生改變，如前列腺素E2(PGE2)生成增加、白細胞介素-12(IL-12)生成減少，進而引起輔助性T細胞(Th2)介導的的抗炎因子IL-4與IL-10的產(chǎn)生增多［9］。已有研究證實嚴重燒傷早期肝臟Kupffer細胞(KCs)是機體釋放細胞因子的主要來源之一，如分泌促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1［10］。Neunaber等［11］在大鼠創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)，股骨骨折經(jīng)髓內(nèi)固定后伴或不伴隨胸部鈍性傷均可促進肺泡巨噬細胞(AM)和肝臟Kupffer細胞分泌IL-6、TNF-α、趨化因子2(CCL2)、CCL3、CCL4、CCL5和CCL7在內(nèi)的細胞因子，進而激活機體免疫應答。Qin等［12］在探究醉酒后發(fā)生燒傷的患者機體炎癥反應及免疫功能的變化時發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達水平下調(diào)，該變化參與介導了燒傷后的免疫功能失衡。West和Mold［13］發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷患者單核細胞內(nèi)血紅素加氧酶1(HO-1)水平增加，但并未發(fā)現(xiàn)其與HLA-DR表達降低及單核細胞的失活相關。

2 創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞功能變化的分子機制

2.1 PI3K/Akt信號通路活性受抑，致單核-巨噬細胞黏附力和吞噬能力下降 磷酯酰肌醇3激酶/絲氨酸激酶(PI3K/Akt)信號通路在細胞代謝、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用。近期有研究者在電灼傷模型中發(fā)現(xiàn)經(jīng)電灼傷的小鼠血清可誘導單核細胞分泌TNF－α并增強單核細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附能力，通過阻斷PI3K/Akt信號通路可以抑制單核細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附［14］。Hsieh等［15］在創(chuàng)傷失血小鼠模型中發(fā)現(xiàn)肝臟Kupffer細胞噬菌能力降低，但該變化與細胞缺氧及HIF-1的活性升高無關，而與Akt的活性受抑制有關［16］。

2.2 MafB(V-maf musculoaponeurotic fibrosacroma oncogene homolog)信號通路活化，上調(diào)巨噬細胞的分化 嚴重燒傷小鼠骨髓中多能造血干細胞及粒細胞單核細胞前體細胞(GMPs)的數(shù)量顯著增加。燒傷小鼠GMPs的球蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(GATA-1)表達明顯降低，而該因子對樹突狀細胞(DC)的分化是必需的。與此相反，燒傷小鼠GMPs的MafB與M-CSFRs的表達呈現(xiàn)高水平，這二者均與單核細胞的生成有關。與假傷組相比，來自燒傷組小鼠的GMPs向巨噬細胞分化的數(shù)量升高至1.7倍以上，而向DC分化的數(shù)量降低至1.6倍以下。進一步分析發(fā)現(xiàn)，燒傷后GMPs中升高的MafB可通過下調(diào)GATA-1及上調(diào)M-CSFRs的表達量，進而抑制單核細胞分化為DC，但促進其分化為巨噬細胞［2］。

2.3 Fas/FasL信號通路激活，調(diào)節(jié)促炎和抑炎介質(zhì)的產(chǎn)生Seitz等［17］在大鼠胸部創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞表面Fas/FasL系統(tǒng)被激活，由于FasL的激活，導致肺泡巨噬細胞釋放促炎因子。Niesler等［18］學者也發(fā)現(xiàn)肺泡巨噬細胞(AM)表面FasL與Fas受體結(jié)合后，激活Fas/FasL系統(tǒng)，這不會誘發(fā)AM發(fā)生凋亡，但會改變細胞因子的釋放。在實驗中證實遭受胸部鈍性傷后的大鼠體內(nèi)使用可溶性FasL刺激后，AM中IL-6水平升高，IL-10水平下降，然而單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)表達無明顯改變。這些結(jié)果均提示Fas/FasL系統(tǒng)在胸部創(chuàng)傷后介導機體炎癥應答過程中的確表現(xiàn)出重要作用。

2.4 NF-κB信號通路活化，影響細胞因子的分泌 NF-κB在創(chuàng)傷后炎癥反應中，通過提高p65/p50磷酸化水平或提高與相應DNA位點結(jié)合，從而激活該信號通路以介導炎癥介質(zhì)的生成。Lopez等［4］通過分析燒傷小鼠腹腔巨噬細胞在LPS刺激下的NF-B的p65Ser536磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)其水平增高與其對LPS的高應答狀態(tài)及過度激活密切相關。Suzuki等［19］在創(chuàng)傷出血模型中發(fā)現(xiàn)過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)通過提高NF-B與相應DNA位點結(jié)合促進了肝臟Kupffer細胞釋放細胞因子。有學者發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷失血模型小鼠Kupffer細胞吞噬功能降低的同時，伴有p38 MAPK和NFB活性增加［16］。Chen等［10］將燒傷大鼠肝臟Kupffer細胞進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高遷移率族蛋白1(HMGB1)刺激后，通過TLR信號轉(zhuǎn)導通路介導肝臟Kupffer細胞的NF-B活性增加，進而增強促炎因子TNF-α、IL-1的分泌。

2.5 MCP-1/CCL-2及CCR2信號通路激活，增強單核-巨噬細胞的趨化能力但下調(diào)炎癥反應 Seitz等［20］觀察到胸部損傷后肺泡灌洗液中趨化因子水平、肺巨噬細胞數(shù)量和單核細胞遷移至肺部的百分比均升高。同時發(fā)現(xiàn)肺挫傷提高了單核細胞、肺間質(zhì)巨噬細胞CCR2的mRNA表達及肺巨噬細胞中單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的mRNA表達。由此可見，胸部鈍性傷后肺巨噬細胞可通過釋放趨化因子，從而提高潛在的刺激單核細胞遷移的能力，而單核細胞通過上調(diào)這些趨化因子受體的表達，然后遷移至肺組織。Suresh等［21］在肺挫傷小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，肺組織中MCP-1/CC趨化因子配體-2(CCL-2)水平明顯增高，進一步實驗證實，應用多克隆抗體中和CCL-2后，損傷肺組織灌洗液中白蛋白、IL-6含量增加且肺組織中髓過氧化物酶活性更高;應用CCR2－/－小鼠制備肺損傷模型，其釋放的IL-1、IL6、巨噬細胞炎性蛋白-1(MIP-1)、角質(zhì)細胞趨化因子(相當于人IL-8)及浸潤的中性粒細胞更多，肺泡巨噬細胞雖然減少但以M1表型(促炎表型)為主，說明肺挫傷后升高的CCL-2可通過作用于CCR2下調(diào)炎癥反應從而發(fā)揮對肺損傷的保護作用。

2.6 TGF-β、MCSF和C反應蛋白(CRP)促進單核細胞亞群分化嚴重創(chuàng)傷患者單核細胞CD14highCD16+亞群明顯擴增，且與創(chuàng)傷血清中高水平的TGF-β、MCSF和CRP密切相關。通過健康志愿者單核細胞與創(chuàng)傷血清共培養(yǎng)，結(jié)合血清中細胞因子抗體中和實驗，證實創(chuàng)傷血清中高濃度的TGF-β和MCSF是激活并誘導單核細胞分化為高表達CD14和CD16亞群的主要細胞因子。而創(chuàng)傷急性期外周血清中高水平CRP則可作用于單核細胞的CD16(CD16被認為是CRP的受體)，促進CD14highCD16+亞群產(chǎn)生抗炎細胞因子，后者介導了創(chuàng)傷后的免疫抑制狀態(tài)［3］。

3 創(chuàng)傷/燒傷后單核－巨噬細胞功能失衡的逆轉(zhuǎn)措施

3.1 普萘洛爾 腎上腺素能受體阻斷劑－普萘洛爾已被證實可改善嚴重燒傷機體的高代謝狀態(tài)。Muthu等［22］進一步發(fā)現(xiàn)燒傷小鼠的交感神經(jīng)興奮性增加，進而促進單核細胞的生成以及巨噬細胞釋放細胞因子。其中高表達F4/80+Grl+的小鼠巨噬細胞屬于炎性表型，燒傷后給予普萘洛爾可減少因燒傷誘導的炎性單核細胞的增多，同時增加粒細胞數(shù)量，進而改善了燒傷后粒細胞和炎性單核細胞的炎癥應答能力。

3.2 重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)劉繼松等［23］通過臨床對比研究發(fā)現(xiàn)外用rhGM-CSF凝膠劑與單純凝膠劑基質(zhì)相比能夠促進深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面壞死組織的脫落，加快創(chuàng)面愈合。其可能機制為:(1)rhGM-CSF可趨化血液中的中性粒細胞和單核細胞遷移至創(chuàng)面，并活化其功能，表現(xiàn)為增強中性粒細胞、巨噬細胞的氧化代謝，上調(diào)巨噬細胞數(shù)量，增強其吞噬及分泌功能，利于自身清除創(chuàng)面的壞死組織和細胞碎片，使創(chuàng)面壞死組織脫落。(2)rhGMCSF可通過激活的炎性細胞釋放各種蛋白酶，以促進燒傷創(chuàng)面壞死組織的分解和脫落。許多研究已證實殼聚糖通過調(diào)節(jié)中性粒細胞與巨噬細胞來促進燒傷創(chuàng)面的愈合。

3.3 雌激素 Hsieh等［15］報道，雌激素體內(nèi)應用可通過增加創(chuàng)傷失血動物Kupffer細胞的Akt磷酸化水平，維持其Fc受體及ATP含量，進而逆轉(zhuǎn)其受抑的吞噬能力，并使其外周血清中升高的TNF-α、IL-6和IL-10水平趨于正常。相反，同時應用雌激素受體拮抗劑ICI 182，780、PI3K抑制劑Wortmannin則可消除雌激素的上述保護效應。

3.4 興奮迷走神經(jīng) 提高迷走神經(jīng)興奮性旨在增加迷走神經(jīng)信號輸出，改變免疫細胞的炎性調(diào)定點，調(diào)整損傷后的炎性應答。Lopez等［4］在觀察到燒傷小鼠體內(nèi)腹腔巨噬細胞處于高活化狀態(tài)的同時，嘗試興奮迷走神經(jīng)對其干預效應。發(fā)現(xiàn)興奮燒傷組小鼠迷走神經(jīng)可有效降低巨噬細胞在LPS刺激下的p65Ser536磷酸化水平，進而確定了迷走神經(jīng)興奮對阻斷腹膜巨噬細胞活化減輕炎癥反應具有保護作用。探究迷走神經(jīng)信號通路在抗炎中的作用已經(jīng)顯示出極大的臨床可行性。

3.5 siRNA策略 通過對燒傷小鼠粒細胞單核細胞前體細胞(GMP)來源的單核細胞進行siRNA轉(zhuǎn)染以沉默MafB表達，則可提高GATA-1表達水平并部分恢復燒傷動物的單核細胞向樹突狀細胞分化的能力［6］。

4 展望

深入研究創(chuàng)傷/燒傷后單核－巨噬細胞功能紊亂的分子機制對于開發(fā)新型免疫調(diào)節(jié)策略無疑具有重要的臨床意義。但目前臨床上對于傷后單核－巨噬細胞數(shù)量及功能監(jiān)測多采用外周血單核細胞，而對機體巨噬細胞的功能監(jiān)測因取材困難常不能實施。事實上巨噬細胞的異質(zhì)性決定了不同部位的巨噬細胞在傷后表現(xiàn)為不同的變化特征，而外周血中單核細胞功能的監(jiān)測結(jié)果只能反應單核-巨噬細胞功能的一個側(cè)面。加之創(chuàng)傷后的不同階段可致單核－巨噬細胞發(fā)生由“激活”到“失活”、由“促炎”向“抗炎”的轉(zhuǎn)變，從而使得臨床上單方面實施“免疫抑制”或“免疫增強”策略變得無所適從。目前對創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞功能變化的分子機制研究尚不夠深入，故相應的調(diào)節(jié)措施存在著“逆轉(zhuǎn)某一個或幾個指標變化”的局限性。推測未來的發(fā)展趨勢可能包括以下幾個方面:(1)研發(fā)新型的免疫檢測手段，以全面、客觀、適時地反映機體傷后的免疫應答水平;(2)應用現(xiàn)代免疫學及分子生物學新技術(shù)揭示創(chuàng)傷后免疫功能紊亂的精細調(diào)節(jié)機制;(3)以是否能改善傷者預后(如降低傷后膿毒癥及多器官功能衰竭發(fā)生率)及提高生存率為標準來評估免疫調(diào)節(jié)策略的有效性。相信隨著研究的深入，創(chuàng)傷/燒傷后單核-巨噬細胞功能失衡的分子機制將不斷被揭示，新型有效的免疫調(diào)節(jié)策略將不斷被發(fā)掘。

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