巖藻黃素對阿霉素引起心肌細胞毒性的保護作用研究

王 飛，趙玉勤，丁國芳，羅李王，張亞茹，楊最素

（1.浙江海洋學院食品與醫藥學院，浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316022）

巖藻黃素對阿霉素引起心肌細胞毒性的保護作用研究

王 飛1，趙玉勤1，丁國芳2，羅李王1，張亞茹1，楊最素1

（1.浙江海洋學院食品與醫藥學院，浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316022）

主要探究了巖藻黃素（Fucoxanthin,FUC）對阿霉素（adriamycin，ADR）引起心肌細胞毒性的保護作用。采用DPPH法測定FUC對自由基的清除作用；通過MTT法檢測FUC對ADR引起H9C2細胞毒性的保護效果；AO/EB染色法觀察H9C2細胞的形態學變化；經Carboxy-DCFDA法測定H9C2細胞內活性氧生成水平變化及Western Blotting檢測H9C2細胞凋亡相關蛋白表達。結果表明：DPPH法結果顯示FUC具有較強的清除氧自由基能力，IC50小于Vc；FUC對ADR引起的H9C2細胞毒性有較好的保護作用；FUC可以減少ADR引起的H9C2細胞凋亡小體的增加；FUC能抑制由ADR引起的H9C2細胞內活性氧水平升高；FUC可以抑制ADR引起的H9C2細胞內凋亡蛋白Caspase-8水平的下調以及Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP水平的上調。結論：FUC具有保護ADR引起心肌細胞毒性的作用，其機理有可能是通過其抗氧化活性抑制ADR引起的心肌細胞氧化應激，進而抑制由ADR引起心肌細胞Caspase-8的活化，進一步抑制由ADR引起的Caspase-3激活及對PARP的剪切來保護心肌細胞的。

阿霉素；心肌細胞毒性；巖藻黃素

阿霉素（Adriamycin，ADR）是一種蒽環類抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。阿霉素主要適用于急、慢性白血病及惡性淋巴瘤、乳腺癌等實體瘤[1]。然而，在臨床應用過程中，其結構中蒽環以及醌基產生大量的活性氧自由基（ROS），引起線粒體、微粒體脂質過氧化，對心肌細胞產生強烈的損傷作用，產生阿霉素心臟毒性[2-4]，這將嚴重影響患者的身心健康。因此，找到能降低阿霉素心臟毒性的藥物對其臨床應用非常必要。

右丙亞胺(Dexrazoxane，DEX)是美國Chiron公司開發的一個強效IE向心臟保護藥，是目前唯一被證實，在癌癥患者接受蒽環類藥物治療過程中有心臟保護作用的藥物。右丙亞胺與ADR聯合應用時對后者的心臟毒性有保護作用，但其發揮心臟保護作用的機制尚不十分清楚，有關其作用機制的報道大多來自離體試驗和動物試驗[5,6]。但右丙亞胺一般比較容易耐受，近來的報道稱右丙亞胺在減弱ADR心臟毒性的同時也降低了ADR的抗腫瘤效果，同時具有引發繼發性惡性腫瘤的風險的可能，比如急性白血病[7]；且其價格昂貴。因此，探尋一種新的保護ADR引起心臟毒性同時不減弱ADR的抗腫瘤效果的保護劑成為ADR臨床應用的迫切需要。

研究發現，海藻提取物中很多具有抗氧化和抗癌功能[8]。巖藻黃素（fucoxanthin，FUC）也稱褐藻黃素，是自可食用褐藻中，如裙帶菜Undaria pinnatifida、海帶Laminaria japonica aresch和馬尾藻Sargassum fulvellum等提取出來的天然類胡蘿卜素。目前大量文獻表明，FUC具有清除活性氧自由基的作用，抗氧化能力十分強[9,10]，且FUC對腫瘤細胞有明顯的抑制作用[11]。由以上可推測，FUC可能對ADR引起的心臟毒性有保護作用，并且與ADR合用可能具有更強的抗腫瘤效果。本課題主要是對FUC對ADR引起的心臟毒性保護進行研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株

大鼠原代心肌H9C2細胞株購于中科院上海細胞庫，由本實驗室傳代保存。

1.2 藥物與試劑

巖藻黃素（成都普瑞法科技開發有限公司）；阿霉素（浙江海正藥業股份有限公司）；DMEM培養基和胎牛血清（美國Gibco公司）；MTT（美國Sigma公司）；AO/EB（吖啶橙/溴化乙錠）（杭州昊天生物技術有限公司）；Cleaved Caspase-3、PARP、Caspase-8抗體與辣根酶標記的山羊抗小鼠辣根酶標記抗體、山羊抗兔辣根酶標記抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 主要儀器

ZHJH-C1209C型超凈工作臺（上海智誠分析儀器制造有限公司）；酶標儀（美國Bio-Rad公司）；easyCyte6 HT-2L流式細胞儀（Millipore公司）；BX2-FLB3熒光顯微鏡（OLYMPU公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Fluor Chem FC3化學發光成像分析系統（美國Alpha公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 DPPH法測定巖藻黃素對自由基的清除作用

取2 μL FUC樣品液（50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L），加入25 μg/mL的DPPH甲醇溶液200 μL，混勻，室溫靜置30 min。以甲醇做空白對照，在517 nm下測吸光度值。以Vc作為陽性對照。DPPH自由基清除率按以下公式計算：

其中，As為DPPH溶液的吸光值，Ai為加入FUC或VC后的吸光值

以半數抑制率（IC50）表示清除活性。

算得樣品相應濃度下的酶抑制百分率，用Logit法計算IC50及95%可信度。

1.4.2 MTT法測定巖藻黃素對阿霉素引起H9C2細胞毒性的保護作用

取H9C2細胞，用DMEM培養液吹勻成細胞懸液，用細胞計數板計數后稀釋成濃度3×104個細胞/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔常規培養液100 μL，置于細胞培養箱中培養24 h后加入FUC，每個濃度設置3個復孔。加FUC（0、25、50 μmol/L）后放入培養箱繼續培養24 h后加入ADR（0.016、0.08、0.4、2、10 μmol/L），ADR作用24 h后，每孔加MTT每孔加10%MTT 200 μL，培養箱中培養4 h吸凈，加DMSO 150 μL，震蕩10 min，最后酶標儀（λ=490 nm）下檢測吸光度（OD值），最后計算細胞抑制率：

1.4.3 AO/EB染色法觀察H9C2細胞形態變化

于6孔培養板內放入經處理過的蓋玻片，將濃度為1×105/mL H9C2細胞懸浮接種于培養板中的蓋玻片上，常規條件下培養24 h，棄培養液，加50 μmol/L FUC處理24 h后聯合應用2 μmol/L ADR處理H9C2細胞24 h及設立ADR和FUC單用組，并設立空白對照組。24 h后，取出蓋玻片，用95%乙醇固定30 min。（取AO和EB各1 mg分別溶解于10 mL pH7.2的PBS緩沖液中，搖勻混合，現配現用，避光保存。）觀察前于載玻片上滴加40 μL PBS和10 μL AO/EB混合液，有細胞的一面朝下，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.4 Carboxy-DCFDA法測定H9C2細胞內活性氧生成水平變化

細胞接種與實驗分組同“1.4.3”。24 h后，除去培養液后用消化液消化，并用PBS洗兩遍，加入終濃度為15 μmol/L的Carboxy-DCFDA在37℃水浴中孵育30 min。將細胞用PBS洗兩次，最后流式細胞儀在FL-1通道來測定綠色熒光強度，計算ROS含量變化。染色操作過程需在黑暗條件下進行。

1.4.5 Western Blotting檢測H9C2細胞凋亡相關蛋白表達

設立FUC（50 μmol/L）、ADR（2 μmol/L）、FUC與ADR合用及空白對照組，加入RIPA(250 μL/50 mm2) +PMSF(10 μL/mL)后反復吹打，冰上細胞裂解30 min。收集細胞裂解液，離心，收集上清液。按照測定的蛋白含量取等體積的蛋白提取液，與5×SDS Loading按1:4的比例均勻混合后變性，-80℃儲存備用。變性后的蛋白提取液采用SDS-PAGE電泳法，按照實驗需要先后配置分離膠和濃縮膠；取蛋白樣品各25 μL經上樣緩沖液處理后上樣，電壓60 v電泳25 min后轉換電壓100 v，電泳90 min；采用濕法將蛋白轉印至PVDF膜上，將PVDF膜至于5%脫脂奶粉中4℃封閉2 h；用TBST 10 mL溶液洗3次，TBS 10 mL溶液洗膜1次，將膜置于1%BSA溶液稀釋后的一抗的雜交袋，4℃孵育過夜；洗膜后加入1%BSA的溶液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，4℃搖床孵育2 h后，洗膜后用ECL顯影，使用Alpha化學發光儀進行掃描并記錄光密度強度。以β-actin作為內參對照校正并做相對量分析。

1.4.6 數據處理

所有實驗組均進行3次平行試驗，實驗數據使用SPSS 19.0統計軟件分析處理，實驗結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 DPPH法結果

物質清除DPPH的能力反映其抗氧化活性的強弱。不同濃度的FUC的DPPH清除能力如圖1所示，不同濃度的FUC具有不同的DPPH清除能力，且呈現出濃度依賴性。FUC 12.5 μmol/L和Vc 12.5 μmol/L濃度下對DPPH的清除率分別為64.2%和33.0%，FUC和Vc的IC50分別為10.88 μmol/L和14.37 μmol/L。

圖1 DPPH法測定巖藻黃素自由基清除作用結果Fig.1 Determination of free radical scavenging effect of fucoxanthin by DPPH

2.2 MTT結果

不同濃度的ADR合用不同濃度FUC對H9C2細胞的抑制率如表1所示，ADR合用FUC后對H9C2細胞的抑制率明顯降低。當ADR的濃度為2 μmol/L，FUC的濃度為0 μmol/L時，H9C2細胞的抑制率為52.75±4.98%。當ADR的濃度為2 μmol/L，FUC的濃度為25 μmol/L時，H9C2細胞的抑制率為41.88±6.67%（P<0.05）。當ADR的濃度為2 μmol/L，FUC的濃度為50 μmol/L時，H9C2細胞的抑制率為39.80±2.57%（P<0.05）。FUC與ADR合用組相比ADR單用組H9C2細胞的抑制率明顯降低，且FUC對ADR引起H9C2細胞毒性的保護作用呈濃度依賴性。

表1 MTT法測定巖藻黃素對H9C2細胞的保護作用結果Tab.1 Protective effect of fucoxanthin on H9C2 cells was determined by MTT method

2.3 AO/EB染色法結果

空白對照組、FUC單用組、ADR單用組及FUC與ADR合用組中H9C2細經AO、EB雙重染色,熒光顯微鏡下觀察,結果如圖2所示。空白對照組和FUC單用組無明顯凋亡細胞。ADR單用組出現大量H9C2早期凋亡細胞，表現為細胞核為AO染色呈黃綠色熒光,濃聚成新月形或顆粒狀,位于細胞的一側。另外，還有少量晚期凋亡細胞并有凋亡小體出現，表現為細胞核為EB染色呈桔紅色，濃聚和偏向。而FUC與ADR合用組中H9C2細胞凋亡數明顯低于ADR單用組。

圖2 AO/EB對H9C2細胞染色結果（200）A：空白對照組B：巖藻黃素50 μmol/L；C：阿霉素2 μmol/L；D：巖藻黃素50 μmol/L+阿霉素2 μmol/LFig.2 AO/EB staining results of H9C2 cells（200）A:Control B.FUC 50 μmol/L;C:ADR 2 μmol/L;D:ADR 2 μmol/L+FUC 50μmol/L

2.4 Carboxy-DCFDA法結果

生理情況下，活性氧自由基的產生和清除處于動態平衡，任何原因致自由基產生過多和/或自由基清除不力均可致自由基凈水平的增加，進而引發脂質過氧化損傷，且脂質過氧化的多種降解產物如MDA可致染色體斷裂、DNA交聯損傷等。從圖3中可以看出空白組與FUC單用組的H9C2細胞ROS水平較低，ADR單用組H9C2細胞ROS水平明顯高于正常組與FUC單用組，而FUC與ADR合用組H9C2細胞ROS水平較ADR單用組明顯下降(P<0.05)。

2.5 Western Blotting結果

空白對照組、FUC單用組、ADR單用組及FUC與ADR合用組中H9C2細胞內Caspase-8、Cleaved Caspase-3、PARP的蛋白電泳條帶如圖4所示。圖4中，FUC單用組的Caspase-8、Cleaved Caspase-3、PARP的水平較空白對照組未有明顯變化；ADR單用組Caspase-8的水平明顯下降，Cleaved Caspase-3、PARP裂解片段（Cleaved PARP）的水平明顯升高；FUC與ADR合用組中Caspase-8的水平較ADR單用組明顯上調，Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP的水平明顯低于ADR單用組。從結果中可以看出，FUC對ADR引起的H9C2細胞內的Caspase-8水平下降有明顯的上調作用，對ADR引起的Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP水平升高具有顯著的下調作用。

圖4 Caspase-8、PARP、Cleaved Caspase-3蛋白表達電泳圖Fig.4 Caspase-8,PARP,Caspase-3 Cleaved protein electrophoresis bands

3 結論與討論

本課題對巖藻黃素對阿霉素引起心肌細胞毒性的保護作用進行了探究。首先，我們通過DPPH法測定了巖藻黃素對自由基的清除能力，結果顯示其IC50為10.88 μmol/L，對自由基的清除能力強于Vc，說明巖藻黃素具有較強的抗氧化能力。其次，我們通過MTT法檢測巖藻黃素對阿霉素引起H9C2細胞毒性的保護作用，結果顯示巖藻黃素與阿霉素合用后H9C2細胞的抑制率明顯下降，且巖藻黃素對阿霉素引起H9C2細胞毒性的保護作用呈濃度依賴性。通過AO/EB染色法觀察H9C2細胞形態變化，結果顯示阿霉素合用巖藻黃素后H9C2細胞凋亡小體明顯減少，表明巖藻黃素可以顯著抑制由阿霉素引起的心肌細胞凋亡，對心肌細胞毒性具有較強的保護作用。

研究發現，阿霉素是通過降低心肌細胞內抗氧化酶活性，造成自由基清除功能障礙，從而引起心肌細胞氧化損傷的[12]。活性氧簇ROS是細胞代謝的副產物，少量的ROS有助于促進細胞的增殖和分化，然而過量的ROS能對細胞內的脂類、蛋白質和DNA造成氧化損傷[13,14]。從DPPH的實驗結果中，我們已經得知巖藻黃素具有較強的抗氧化能力。進一步，我們通過Carboxy-DCFDA法測定了H9C2細胞內活性氧生成水平變化，得出阿霉素與巖藻黃素合用后能夠顯著抑制由阿霉素誘導的H9C2細胞內活性氧水平升高，表明巖藻黃素有可能是通過減少H9C2細胞內活性氧的產生，抑制心肌細胞的氧化應激對心肌細胞毒性產生保護作用。

另有研究表明，細胞凋亡的死亡受體途徑依賴于ROS[15]。所以，我們進一步推測巖藻黃素對H9C2心肌細胞的保護機制有可能與阻斷死亡受體途徑有關。為驗證我們的推測，本研究通過Western Blotting對H9C2細胞死亡受體途徑相關凋亡蛋白的表達進行了檢測。在死亡受體介導的細胞凋亡途徑中,Caspase-8是關鍵的啟動型Caspase。從我們的實驗結果中可以看出，巖藻黃素與阿霉素合用組中Caspase-8的水平明顯高于阿霉素單用組，說明巖藻黃素有可能通過抑制阿霉素誘導的Caspase-8活化，從死亡受體途徑上游抑制H9C2細胞的凋亡，對阿霉素引起的心肌細胞毒性產生保護作用。

在死亡受體途徑中后期，活化后的Caspase-8能夠引發Caspase蛋白酶解級聯反應，并進一步鏈式水解激活其下游的同源酶，如Caspase-6、Caspase-7等，最后激活其效應物Caspase-3發生凋亡效應。Caspase-3是細胞凋亡下游的關鍵執行者。活化的Caspase-3可以降解ADP-核糖多聚合成酶(PARP)，激活核內核酸內切酶，使核小體間DNA鏈水解斷裂，產生凋亡所特有的DNA節段化。在我們的實驗結果中可以看出巖藻黃素與阿霉素合用組中Cleaved Caspase-3與Cleaved PARP的水平明顯低于阿霉素單用組，說明巖藻黃素有可能通過抑制由阿霉素引起死亡受體抑制下游關鍵Caspase的活化從而對H9C2細胞毒性進行保護。

綜上所述，本實驗得出巖藻黃素對阿霉素引起心肌細胞毒性具有保護作用，其保護機理有可能是通過其抗氧化活性抑制阿霉素引起的心肌細胞氧化應激，進而抑制由阿霉素引起心肌細胞Caspase-8的活化，進一步抑制由阿霉素引起的Caspase-3激活及對PARP的剪切來保護心肌細胞的。而巖藻黃素是否具有對阿霉素引起心臟毒性的保護作用還需要進一步的體外實驗進行探究。

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The Protective Effect of Fucoxanthin on Adriamycin-induced Cytotoxicity in Cardiac Muscle Cells

WANG Fei1,ZHAO Yu-qin1,DING Guo-fang2,et al
(1.School of Food Science and Pharmacy of Zhe Jiang Ocean University/Zhe Jiang Provincial Engineering Technology Research Center of Marine Biomedical Products,Zhoushan 316022;2.Zhejiang Marine Fisheries Research Institution,Zhoushan 316022,China)

This paper mainly explored the protective effect of fucoxanthin (FUC)on adriamycin-induced cytotoxicity in cardiac muscle cells.The DPPH method used to determinate the free radical scavenging effect of FUC and MTT assay for detecting the protective effect of FUC on adriamycin-induced cytotoxicity in H9C2 cells.AO/EB staining to observe the morphological changes of H9C2 cells,H9C2 cells in ac－tive oxygen generation level changes determined by the Carboxy-DCFDA method and Western blotting detected the expression of apoptosis protein in H9C2 cells.It showed that FUC has strong scavenging oxygen free radical ability in DPPH experiment,with IC50less than VC;FUC against ADR induced H9C2 cells toxicity effect has a good protection effect;FUC can reduce H9C2 cells apoptotic body increased which induced by ADR;FUC can inhibit the elevated levels of reactive oxygen species in the cells induced by ADR;FUC can inhibit the regulation of ADR induced cardiomyocyte apoptosis protein Caspase-8 up and Cleaved Caspase-3，Cleaved PARP down in H9C2 cells.FUC has the protective effect to cardiac cells toxicity induced by ADR,and its protective effect is possibly achieved by inhibiting ADR induced oxidative stress in cardiomyocytes by its antioxidant activity,And then inhibited the activation of Caspase-8 induced by ADR,and further inhibited the activation of Caspase-3 induced by ADR and the shear of PARP to protect cardiomyocytes.

adriamycin；cardiac cells toxicity；fucoxanthin

R966

A

1008－830X(2015)06－0582－06

2015-07-10

浙江省教育廳項目(Y201225031)；浙江海洋學院校級重大項目(X12ZD09)；浙江海洋學院科研啟動經費資助項目（巖藻黃素對阿霉素藥物心臟毒性的保護作用及機理研究）

王飛（1991-），男，碩士研究生，研究方向：海洋藥物.E-mail:wishwangfei@163.com

丁國芳（1958-），教授，碩士生導師，研究方向：海洋藥物.E-mail:dinggf2007@163.com