飲用水中劍水蚤體表攜帶細菌機制研究

蔡 博,謝美萍, 顏 勇,林 濤, 陳 衛

(1.河海大學環境學院,江蘇 南京 210098; 2. 揚州自來水有限責任公司,江蘇 揚州 225000)

飲用水中劍水蚤體表攜帶細菌機制研究

蔡 博1,謝美萍2, 顏 勇2,林 濤1, 陳 衛1

(1.河海大學環境學院,江蘇 南京 210098; 2. 揚州自來水有限責任公司,江蘇 揚州 225000)

研究我國飲用水中劍水蚤體表攜帶細菌的來源,其細菌種屬、優勢菌屬與自然水體中細菌種屬、優勢菌屬的區別,以及細菌在劍水蚤體表分布的情況。結果表明:劍水蚤體表細菌主要來源于自然水體,其細菌種屬與自然水體中的細菌種屬相似度高達74.8 %,而劍水蚤體表細菌的優勢菌屬與自然水體中細菌的優勢菌屬存在的差別較小;自然水體中的優勢菌屬在劍水蚤體表不一定是優勢菌屬;自然水體中自由細菌數量上比劍水蚤體表攜帶的細菌多。利用綠色熒光蛋白標記技術,發現標記綠色熒光蛋白的大腸桿菌在劍水蚤體表分布不均勻,細菌主要聚集在劍水蚤足部、尾部等長有剛毛的部位,劍水蚤背部與腹部關節部位也附著部分細菌,雌性劍水蚤的卵囊是細菌的重要載體。

飲用水;劍水蚤;細菌種屬;優勢菌屬;綠色熒光蛋白;細菌攜帶機制

飲用水安全是公共衛生安全體系的重要組成部分,與人民身體健康和社會穩定息息相關。2006年我國頒布了新的生活飲用水衛生標準(GB 5749—2006),與1985年的標準相比,水質指標由35項增加至106項,特別是規定了隱孢子蟲和賈第蟲(以下簡稱“兩蟲”)的水質標準為小于0.1個/L 。近年來浮游動物作為微生物的攜帶載體,引起的水質安全問題成為研究的新熱點。微生物可黏附在浮游動物的體表,使浮游動物成為微生物的攜帶載體[1]。Meinhard等[2]指出,微生物可黏附在浮游動物的體表中,浮游動物體表攜帶的微生物可占水體微生物總量的10%以上。浮游動物具有傳播細菌的能力,能在單獨的水層之間向上、向下擴散細菌[3]。Wolmarans等[4]發現,浮游動物個體可攜帶10～400個微生物,包括可引起腹瀉的Aeromonashydrophila和引起腦膜炎的Chryseobacteriummeningosepticum。受到浮游動物的保護,浮游動物所攜帶的微生物具有較強的抗消毒能力,對供水安全造成潛在的威脅。Tang等[5]研究表明,浮游動物的體表保護使其攜帶的微生物對余氯的抵抗能力增加30～120倍,未被滅活的微生物釋放至水中,3 d內恢復到106 CFU/mL的水平。Grossart等[6]發現貧營養水體的細菌比富營養化水體的細菌能更加牢固地附著于橈足類浮游動物,能更好地抵御環境波動。國外針對此類焦點問題的研究較早,但對浮游動物黏附細菌的機制缺乏探討,細菌在浮游動物體表分布的情況還未見報道。

現代分子生物學技術能夠揭示DNA序列遺傳多態性,可以用于鑒定生物種群系統發育關系,并通過數據庫比較鑒定未知微生物,其中基于16S rDNA分子生物學技術已被廣泛應用[7-9]。本文以取自某水廠活性炭濾池的劍水蚤為研究對象,通過PCR-DGGE技術分析自然水體中細菌與劍水蚤體表攜帶細菌的種屬差異,探究劍水蚤體表細菌來源,分析優勢菌屬的變化情況,推測細菌在自然水體與劍水蚤體表生存環境的差異。

綠色熒光蛋白標記(GFP)是一種細胞示蹤技術,由于具有自發熒光等特性,可以用于觀察肉眼無法看到的過程,在生物學領域得到廣泛應用[10-12]。本研究采用增強型綠色熒光蛋白(EGFP)對大腸桿菌進行標記,研究大腸桿菌在劍水蚤體表附著分布情況,系統分析細菌在劍水蚤體表附著機制。

1 試驗材料與方法

根據水廠活性炭濾池中水蚤優勢種屬分布情況,本文選用橈足類水蚤中最具代表性的劍水蚤作為研究對象。試驗中所用的器具和耗材均經過高溫滅菌處理,試驗在無菌工作室和超凈工作臺上進行。

1.1 劍水蚤體表細菌的提取與檢測方法

劍水蚤樣取自蘇州市某水廠活性炭濾池,取樣時間為2014年5月。原水水溫為24 ℃,pH值為7.7,DO質量濃度為7.46 mg/L, BOD5質量濃度為1.39 mg/L,TP質量濃度為0.03 mg/L,TN質量濃度為2.74 mg/L。為研究劍水蚤體表細菌與自然水體的關系,試驗過程中采用自然水體喂養劍水蚤。喂養1周后,成體劍水蚤死亡,幼體的劍水蚤正好經歷了從蚤卵發育成熟的過程,取這時的成體劍水蚤進行后續試驗,同時收集部分培養用的太湖水(0.1 mL),用瓊脂培養基37 ℃下培養24 h,收集的菌樣即為自然水體中自由細菌。

取15只成體劍水蚤為1組,置于200目無菌濾網上,用無菌磷酸緩沖液沖洗3遍以上,收集最后一次沖洗液(0.1 mL),用瓊脂培養基37 ℃下培養24 h,檢測水蚤是否沖洗干凈。

將劍水蚤轉移至50 mL離心管中,加入28 mL無菌水和2 mL解吸附試劑。解吸附試劑的成分為:氯化鈉9 %、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯1 %、磷酸氫二鈉2.83 %、磷酸二氫鉀1.36 %、無菌水85.81 %。充分混勻后,2 000 rpm、25 ℃,離心3 min,取離心后的上清液,用瓊脂培養基37 ℃下培養24 h,收集的菌樣即為劍水蚤體表攜帶的細菌。

1.2 細菌基因組DNA提取方法

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取水中自由細菌和劍水蚤體表攜帶的細菌的基因組DNA。細菌基因組DNA提取試劑盒由上海捷瑞生物有限公司提供。用提取得到的DNA模板進行后續的PCR-DGGE試驗,引物使用細菌V3區通用引物(由上海生物工程有限公司合成)518 R:5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3;GC338F:5-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGG CGG GGC GGG GGC GCG GGG GGC CTA CGG GAG GCA GC AG-3[13]對模板DNA進行PCR擴增。PCR程序設定為:使用0.2 mL PCR管,采用50 μL系統;95 ℃預變性5 min,94 ℃變性1 min,65 ℃～55 ℃退火,每循環降低0.5 ℃1 min,72 ℃復性45 s(共循環20次);94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃復性45 s(循環12次);72 ℃延伸8 min;4 ℃保存(共循環32次)。DGGE試驗采用8%聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度梯度為35 %～65 %,電泳電壓120 V,跑膠8 h,SYBR GreenⅠ染色,切膠回收DNA條帶,再送往上海生物工程有限公司進行克隆測序,對DNA測序結果使用Blast鑒定菌種,并進行細菌群落結構分析。PCR混合液和重蒸水(dd H2O)由上海捷瑞生物有限公司提供。PCR 儀器使用Bio-Rad C1000PCR儀。DGGE電泳儀采用Bio-Rad Dcode通用突變檢測系統(Dcode System for DGGE)。

1.3 劍水蚤體表附著細菌形成機制研究方法

為研究水中細菌在浮游動物體表附著分布情況,需要對細菌進行示蹤標記。本研究采用綠色熒光蛋白標記法(GFP),考慮到浮游動物體表攜帶細菌數量有限,選用增強型綠色熒光蛋白(EGFP)作為表達蛋白,表達載體選用pET-28a,表達菌株選用大腸桿菌OP50(E. coli OP50)。EGFP、pET-28a由上海生物工程有限公司提供,大腸桿菌OP50購自南京便診生物科技有限公司。

將上述經過體表細菌解吸附的劍水蚤收集置于無菌200目濾網上,用無菌磷酸緩沖液沖洗3遍以上,然后轉移至一個100 mL無菌燒杯中,加入約50 mL無菌水,并加入經過綠色熒光蛋白表達的大腸桿菌,使水中大腸桿菌濃度約為108CFU/mL。經過3 h,可以認為大腸桿菌已經充分附著于劍水蚤體表[14]。再將劍水蚤置于200目無菌濾網上,用無菌磷酸緩沖液沖洗3遍以上,充分洗凈未被附著的自由細菌。用熒光顯微鏡觀察,熒光激發波波長為484～507 nm。

2 試驗結果與討論

2.1 劍水蚤體表攜帶細菌來源

通過PCR-DGGE試驗,凝膠電泳結果見圖1。泳道1表示自然水體中的自由細菌種屬,泳道2表示劍水蚤體表攜帶的細菌種屬。從圖1中可以直觀地看出劍水蚤體表細菌與水中自由細菌種類基本一致,條帶相似性分析證實了二者相似度高達74.8%。這表明劍水蚤體表攜帶的細菌主要來自于水體環境,且細菌種類與水中自由細菌種類高度一致。Tang等[5]認為浮游動物攜帶的細菌與水體中的自由細菌不是相互孤立的,二者存在一定聯系。水體中自由細菌可以附著于浮游動物體表,成為浮游動物體表攜帶的細菌,同時浮游動物體表攜帶的細菌也可能由于浮游動物劇烈運動,受到水流沖刷作用而進入自然水體成為自由細菌。

注:圖中的數字為條帶編號對應的菌種圖1 細菌基因組DGGE指紋圖譜及條帶相似性分析結果

相似度對應種屬、DNA測序結果見表1。使用Quantity One軟件計算條帶Trace值可以近似分析各菌屬數量上的差異,Trace值以及換算后菌屬所占比例見表2。結合表1與表2,可以發現,由于劍水蚤體表與自然水體環境的差異,導致不同菌屬的數量也存在差異。如,自然水體中的自由細菌1號菌屬鮑氏不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiACICU)的數量約是其在劍水蚤體表的兩倍。而在自然水體中占絕對優勢的3號菌屬變形桿菌屬(Betaproteobacteria bacterium)在劍水蚤體表數量減少較多。整體來看,自然水體中的自由細菌數量比劍水蚤體表細菌豐富。二者在細菌種類上沒有差異,但是各菌屬所占比例以及優勢菌屬種類存在一定差異。

表1 原水水樣中的細菌及劍水蚤體表

表2 DGGE條帶DNA Quantity Trace值

2.2 劍水蚤體表細菌分布情況

GFP熒光顯微鏡分析結果見圖2。劍水蚤身體各部位攜帶細菌能力不一樣,細菌主要富集在劍水蚤的足部,而劍水蚤甲殼質背部的細菌很少,也有少部分細菌藏在劍水蚤背部甲殼的關節部位(圖2(A))。劍水蚤的腹部以及尾部也容易黏附細菌,如圖2(B)和圖2(C)所示。在劍水蚤顎部、腹部與尾部位置有明顯的熒光亮點,表明在這些部位含有大量綠色熒光蛋白標記的細菌。此外,雌性劍水蚤的卵囊也是細菌的重要載體。從圖2(D)中可以看出,雌性劍水蚤的卵囊部位熒光信號強烈,表明劍水蚤卵囊可以攜帶大量細菌。

圖2 劍水蚤體表附著綠色熒光蛋白標記的大腸桿菌

造成細菌在劍水蚤體表分布不均的主要原因是劍水蚤體表結構的差異。劍水蚤屬于橈足類浮游動物,長有5對作為游泳器官的胸足,具有發達的羽狀剛毛。其顎部長有觸角,觸角上也長有羽狀剛毛,方便劍水蚤濾食水中食物。尾叉的背面有縱行隆線,內緣有1列剛毛。甲殼類浮游動物剛毛多由幾丁質物質構成。幾丁質具有豐富的氨基和羥基,對重金屬離子有較高的絡合能力,并且能吸附水中的懸浮顆粒,吸附顏料顏色等,是一種天然吸附劑[15],對細菌也有一定的吸附作用。因而劍水蚤的足部、顎部和尾部是細菌的主要聚集場所。劍水蚤光滑的甲殼經常在游泳的時候受水流沖刷,因而不易穩定附著細菌,但是其甲殼連接部位的節間膜受水流沖刷作用較小,表面存在就較多褶皺,可以任意折疊,具有較強的可伸縮性和較大的比表面[16],容易黏附水中的營養物質,是細菌很好的生長場所,因而在劍水蚤的背部及腹部的關節連接部位富集有細菌。雌性劍水蚤在生殖繁衍時,由輸卵管分泌物把卵集聚成大小、形狀和位置不同的卵囊,懸掛于雌體腹面兩側,形成兩個卵囊。這種輸卵管分泌物在黏附蚤卵的同時,也會附著大量細菌[17]。翟寶香等[18]通過電鏡觀察,發現輪蟲卵表面存在大量氣孔,這些氣孔往往黏附一些物質。劍水蚤的蚤卵與輪蟲卵具有相似的結構,表面也會有大量氣孔,能吸附水中一些物質。這使雌性劍水蚤的卵囊成為細菌的一個重要載體,雌性劍水蚤能夠比雄性劍水蚤攜帶更多數量的細菌[19]。

3 結 論

a. 劍水蚤體表細菌主要來源于自然水體,且與水中的自然細菌存在一定聯系,二者在一定情況下可以相互轉化。

b. 劍水蚤體表細菌與自然水體中的自由細菌在種類上趨于一致,二者相似度高達74.8%,而在優勢菌屬種群上存在略微差別。自然水體中占絕對優勢的自由細菌在劍水蚤體表不一定能成為優勢菌屬。此外,自由細菌在數量上多于劍水蚤體表攜帶細菌。

c. 劍水蚤體表細菌分布不均勻,細菌主要聚集在劍水蚤足部與尾部等長有剛毛的部位,劍水蚤甲殼之間的節間膜,如背部和腹部的關節部位,也長有部分細菌;雌性劍水蚤的卵囊是細菌的重要載體,這也是雌性劍水蚤比雄性劍水蚤對飲用水安全威脅更大的一個原因。

d. 劍水蚤不同部位對細菌的黏附能力不同,不同器官針對細菌的黏附機制不同。

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On bacteria-carrying mechanism of surface ofCyclopsin drinking water

CAI Bo1, XIE Meiping2, YAN Yong2, LIN Tao1, CHEN Wei1

(1.CollegeofEnvironment,HohaiUniversity,Nanjing210098,China;2.YangzhouTapWaterCo.,Ltd,Yangzhou225000,China)

The author of this paper researched the source, species and distribution of the bacteria attached to the surface ofCyclops. The results indicate that the bacteria attached to the surface ofCyclopsare from natural water body, and the similarity of the species between the bacteria attached to the surface ofCyclopsand those in natural water body is as high as 74.8 %. There is a little difference between the dominant bacteria species on the surface ofCyclopsand those in natural water body. The dominant bacteria species in nature water body is not the dominant one on the surface ofCyclops. The number of free-living bacteria in natural water body is more than those attached to the surface ofCyclops. A phenomenon is found that bacteria are distributed unevenly on the surface ofCyclopsby using the technology of green fluorescent protein. The bacteria mainly focus on the foot and tail ofCyclops, which are covered with specialized setae. There are also many bacteria attached to the joint of the back and abdomen ofCyclops. The oocyst of femaleCyclopsis another important carrier of bacteria.

drinking water;Cyclops; bacteria species; dominant bacteria species;green fluorescent protein; bacteria-carrying mechanism

10.3880/j.issn.1004-6933.2015.02.008

國家自然科學基金(51378173)

蔡博(1989—),男,碩士研究生,研究方向為飲用水處理中的浮游動物細菌攜帶機制。E-mail: caibolaodi@126.com

Q938.8

A

1004-6933(2015)02-0040-05

2014-07-01 編輯：彭桃英)