甲氨蝶呤、環磷酰胺對膠原誘導性關節炎大鼠血清TNF-α、IL-1的影響

梁美娥，李小峰，張莉蕓，許 珂，王彩虹，曲世晶

甲氨蝶呤、環磷酰胺對膠原誘導性關節炎大鼠血清TNF-α、IL-1的影響

梁美娥1，李小峰2*，張莉蕓1，許 珂1，王彩虹2，曲世晶3

目的 研究甲氨蝶呤(MTX)聯合環磷酰胺(CTX)治療對膠原誘導性關節炎(Collagen-induced arthritis，CIA)大鼠血清TNF-α、IL-1水平的影響，探討甲氨蝶呤(MTX)聯合環磷酰胺(CTX)治療類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)的機制。方法 建立Ⅱ型膠原誘導的雌性Wistar大鼠CIA模型。取15只未造模的健康大鼠作為健康對照組(A組)。將造模成功的75只大鼠隨機分成5組(每組15只)，B組：造模對照組；C組：小劑量MTX組(每周0.9 mg/kg)；D組：大劑量MTX組(每周2.7 mg/kg)；E組：小劑量CTX組(每3周24 mg/kg)；F組：小劑量MTX聯合小劑量CTX組(MTX每周0.9 mg/kg，CTX每3周24 mg/kg)。分別在6周、24周檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1的水平。結果 聯合應用MTX和CTX優于小劑量MTX、小劑量CTX單藥治療組。結論 MTX和CTX聯合應用在RA的治療中具有協同效應。

膠原誘導性關節炎；甲氨蝶呤；環磷酰胺；協同效應

0 引言

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種高度致殘的自身免疫性疾病，炎性細胞因子在放大全身免疫紊亂和關節局部破壞中發揮了重要作用，以IL-1、TNF-α作用最為顯著，最終導致周圍關節的慢性、對稱性、侵蝕性關節炎以及關節外血管炎。可以改善RA病情的抗風濕藥物有甲氨蝶呤(MTX)、環磷酰胺(CTX)等。以往研究已證實，抗風濕藥物的聯合應用優于單藥治療[1-2]。本研究采用膠原誘導性關節炎(Collagen induced arthritis，CIA)大鼠模型[3]檢測MTX、CTX單藥及聯合用藥后CIA大鼠血清中細胞因子IL-1、TNF-α水平的變化，旨在探討兩者聯合應用在治療RA時是否有協同效應。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 雌性Wistar大鼠，購于山西醫科大學實驗動物中心，體重160～180 g，正常飼養。

1.2 實驗試劑 MTX(上海信誼制藥廠)，CTX(山西大同制藥廠)，天然牛Ⅱ型膠原，完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)，大鼠血清TNF-α檢測試劑盒(晶美生物工程有限公司)，大鼠血清IL-1檢測試劑盒(美國Biosource公司)。

1.3 造模和動物分組 根據文獻[4]的方法加以改進。配制Ⅱ型膠原乳劑，初次免疫采用尾根部、背部、任一后足跖部多點皮內注射法，每只動物注射免疫復合物0.5 mL；2周后加強免疫，腹腔注射免疫復合物0.2 mL(含Ⅱ型膠原0.2 mg)[5]。根據關節炎指數(Arthritis index，AI)評分標準評估造模是否成功。取15只未造模的健康大鼠作為健康對照組(A組)。將75只造模成功的CIA大鼠，于造模第21天隨機分成5組，每組15只，B組：造模對照組；C組：小劑量MTX組(每周0.9 mg/kg)；D組：大劑量MTX組(每周2.7 mg/kg)；E組：小劑量CTX組(每3周24 mg/kg)；F組：小劑量MTX聯合小劑量CTX組(MTX每周0.9 mg/kg，CTX每3周24 mg/kg)。

1.4 給藥方法 初次免疫設為第1天，至動物全部處死，歷時24周。初次免疫后3周，C、D、E、F組開始給藥，治療21周，每3周為1個周期。①MTX：制成MTX混懸液，采用灌胃給藥法，C組0.9 mg/kg，每周1次；D組2.7 mg/kg，每周1次；首次給藥為初次免疫后3周，共給藥21次。②CTX：于給藥當天制成CTX混懸液，采用腹腔注射給藥法；給藥劑量為24 mg/kg，每3周1次；CTX給藥應晚于MTX 1 d，即首次給藥為初次免疫后22 d，共給藥8次。③正常組和造模對照組分別給予等量蒸餾水灌胃及等量0.9%氯化鈉液注射。

1.5 采血及細胞因子的檢測 每只大鼠予5%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，待大鼠肌張力和結膜反射消失后，將其以俯臥位固定于解剖板，用1 cm左右的毛細管于眼眶下采血，留取2 mL全血，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心5 min，取上層血清約1 mL，分裝于離心管，置于-70 ℃保存。于初次免疫前及初次免疫后每3周留取血清，直至24周。采用ELISA法檢測血清中兩種細胞因子的水平。

2 結果

本研究從初次免疫開始歷時24周，A～E組分別存活8、10、9、8、9、9只。

6周與24周時B組大鼠血清中TNF-α、IL-1水平的比較見表1，24周時B組大鼠血清中TNF-α和IL-1水平均明顯高于6周時(P<0.01)，表明在關節炎發生過程中TNF-α、IL-1水平呈現升高趨勢。對24周時各組TNF-α、IL-1水平(見表2)進行單因素方差分析，結果顯示，單獨應用甲氨蝶呤或環磷酰胺對關節炎大鼠TNF-α、IL-1均有抑制作用，兩藥聯合應用時對TNF-α、IL-1的抑制作用更強，兩藥具有協同作用，見表3、表4。

表1 未用藥組細胞因子水平比較(U/L)

表2 24周細胞因子水平比較(U/L)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，▽P<0.05；與D組比較，△P<0.05；與E組比較，※P<0.05

表3 完全隨機分組兩因素析因設計24周TNF-α水平的方差分析表

表4 完全隨機分組兩因素析因設計24周IL-1水平的方差分析表

3 討論

關于RA的發病機制，一種學說認為，RA是抗原驅動，T細胞依賴的細胞因子、黏附分子和降解酶參與的炎癥反應[6]。環境抗原進入機體后經過抗原提呈細胞處理，刺激T細胞、滑膜發生細胞免疫反應，釋放多種細胞因子，從而導致關節損傷；細胞因子是RA炎癥和關節損傷的重要介質，其中以“姐妹細胞因子TNF-а、IL-1”[7]最為重要，它們分別與相應受體TNF-a、IL-1結合后，導致IκB-B發生磷酸化并降解，導致活化NF-κB蛋白的釋放和核轉錄，進一步調節TNF、IL-2、IL-6、IL-12、M-CSF、GM-CSF、G-CSF等細胞因子的表達，這些細胞因子通過調節IL-8、MCP-1、MCP-2等趨化因子而刺激E-cadherin、ICAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達[8]，進一步活化細胞、體液免疫，從而產生如下效應而導致關節炎的發生。①激活并增強血管內皮細胞對黏附分子的表達，使血液中的白細胞通過與黏附分子相互作用而集中在關節腔，刺激結締組織細胞和多形核細胞產生前列腺素等小分子炎癥介質，使得在RA發病早期滑膜增生并滲出大量液體，同時導致關節囊、肌腱和腱鞘發生炎性改變，出現關節明顯腫脹；②襯里層滑膜成纖維細胞大量增生，富含有血管的肉芽組織從關節軟骨邊緣的滑膜向軟骨面伸展，最后將軟骨完全覆蓋，阻斷軟骨從滑液中攝取營養，軟骨發生潰瘍，表面的肉芽組織纖維化，使上下關節面相互融合，形成纖維性強直；③刺激滑膜細胞和軟骨細胞，使破骨細胞減少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并產生過量的膠原酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶、纖維蛋白溶酶激活劑、一氧化氮、基質溶素、蛋白聚糖、變性蛋白酶，使得軟骨基質崩解，骨質疏松，肌肉和皮膚萎縮，關節本身畸形或脫位；④有活性的NF-κB在細胞核內通過抑制胱天蛋白酶-8、10途徑發揮抗凋亡作用，從而阻斷淋巴細胞、樹突細胞、巨噬細胞、滑膜細胞的凋亡，并使免疫細胞發揮正常功能，從而導致免疫系統的紊亂和局部炎癥反應的持續[9]。故TNF-α、IL-1是RA炎癥形成、血管翳進一步增生、軟骨和骨破壞的“罪魁禍首”[10-12]。

目前，MTX是治療RA的首選藥物。它是二氫葉酸還原酶抑制劑，通過使胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成原料耗竭而抑制DNA和RNA的合成，從而發揮細胞毒作用[13-17]。MTX主要作用于S期，對G0/G1到S期轉換有延緩作用。MTX的常用劑量為7.5～25 mg/周，其療效容易達到平臺即類似耐藥現象，而增加劑量可引起較多不良反應；故在RA的治療中常采取MTX聯合其他藥物的治療方案。CTX是烷化劑，主要抑制DNA合成，同時對RNA和蛋白質合成也有抑制作用；其對各期細胞均有殺傷作用，尤其對G0/G1期和G2/M期細胞殺傷作用最強，屬細胞周期非特異性藥物。在治療RA時，MTX、CTX聯合應用可增強細胞毒作用[2]；同時，應根據細胞周期，小劑量間歇性點式給藥。有體外實驗證實：聯合組較單藥組對RA患者外周血淋巴細胞(PBL)抑制率明顯增加；細胞周期檢測，聯合組PBL的G0/G1期比例明顯增多，細胞增殖指數降低，表明MTX、CTX聯合用藥在抑制RA患者的PBL增殖方面可能有協同作用[18]。

本研究顯示，未用藥組CIA大鼠24周時血清中TNF-α、IL-1水平高于6周時，表明在關節炎發生過程中TNF-α、IL-1水平呈現升高趨勢；24周時小劑量聯合治療組與高劑量MTX組對TNF-α、IL-1水平的影響程度相當，明顯優于小劑量單用藥組；進一步對24周時各藥對TNF-α、IL-1影響的析因設計的方差分析結果顯示，MTX與CTX聯合應用時具有協同作用。

綜上所述，MTX與CTX具有協同作用，故二者聯合應用于RA的治療，可能效果更好。

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Effect of methotrexate and cyclophosphamide intermittent combination therapy on serum levels of IL-1,TNF-α in collagen-induced arthritis rats

LIANG Mei-e1,LI Xiao-feng2*,ZHANG Li-yun1,XU Ke1,WANG Cai-hong2,QU Shi-jing3

(1.Department of Rheumatology and Immunology,Shanxi Dayi Hospital,Taiyuan 030032,China; 2.Department of Rheumatology and Immunology,The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China; 3.Department of Internal Medicline,The Third Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)

Objective To study the effect of methotrexate (MTX) and cyclophosphamide (CTX) intermittent combination therapy on serum TNF-α and IL-1 levels in collagen-induced arthritis (CIA) rats,in order to investigate the possible synergistic effect of the two drugs in the treatment of rheumatoid arthritis (RA).Methods A total of 90 Wistar rats were involved.Among them,75 received two times mixed liquor of cattle Ⅱ collagen and Freund′s complete adjuvant (CFA) by endermic injection to construct CIA rat model,and then divided into 5 groups randomly (15 rats in each group) and received MTX and CTX intermittent combination therapy or control drugs,respectively for 24 weeks.Another 15 non-CIA model rats were included as control group.The changes of arthritis index,arthritis swelling degree,and appearance of imageology and pathology were observed; the serum levels of IL-1 and TNF-α were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results MTX in the doses of 0.9 mg/kg and 2.7 mg/kg a week could inhibit the appearance of arthritis and serum levels of IL-1 and TNF-α in CIA rats.CTX in a dose of 24 mg/kg every 3 weeks had the same effects.Combination of MTX 0.9 mg/kg a week and CTX 24 mg/kg every 3 weeks could inhibit arthritis index,arthritis swelling degree,and serum levels of IL-1 and TNF-α in CIA rats obviously,and the effect was better than single use of MTX or CTX.Conclusion MTX and CTX have synergistic effects at low dosage in the treatment of CIA.

Collagen-induced arthritis；Methotrexate；Cyclophosphamide；Synergistic effect

2015-01-13

1.山西大醫院風濕免疫科，太原 030032；2.山西醫科大學第二醫院風濕免疫科，太原 030001；3.山西醫科大學第三醫院內科，太原 030001

山西省自然科學基金(200711116)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507007

*通信作者