hsa-miR-342-3p生物信息學分析

馬占兵,耿 芝,焦海燕,2,霍正浩,2*

(1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳系與細胞生物學系,銀川 750004；

2.寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點實驗室, 銀川 750004)

hsa-miR-342-3p生物信息學分析

馬占兵1，2,耿 芝1,焦海燕1,2,霍正浩1,2*

(1.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳系與細胞生物學系,銀川 750004；

2.寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點實驗室, 銀川 750004)

摘要：通過生物信息學方法預測hsa-miR-342-3p靶基因及其功能機制。檢索PubMed 有關hsa-miR-342-3p的研究報道并進行功能分析；檢索miRBase獲取hsa-miR-342-3p序列；通過TargetScan, Pictar 和PITA數(shù)據(jù)庫預測靶基因并取交集,對其進行組織和疾病特異性表達譜分析、功能富集分析(GO enrichment analysis)、信號轉導通路富集分析(Pathway enrichment analysis)和蛋白質相互作用網絡分析(PPI analysis)。結果發(fā)現(xiàn)： hsa-miR-342-3p序列在多物種間具有高度保守性; hsa-miR-342-3p在腎臟組織和急性淋巴細胞性白血病、乳腺癌疾病中表達水平較高(RPM≥1 000)；預測得到14個hsa-miR-342-3p靶基因；靶基因分子功能分別富集于轉化生長因子活性、DNA結合和蛋白激酶激活等(P<0.05); hsa-miR-342-3p靶基因GO生物學過程主要集中于大分子代謝抑制，肺部組織發(fā)育、呼吸系統(tǒng)發(fā)育及管狀組織發(fā)育建成(P<0.05)；細胞信號通路主要富集于TGF-Beta信號通路、細胞因子、受體作用信號通路及前列腺疾病信號通路(P<0.01)。hsa-miR-342-3p在體內分布廣泛，預測的靶向TGF-Beta信號通路可能在疾病發(fā)生中發(fā)揮重要調控作用，是具有潛在研究價值的生物學靶標。

關鍵詞：hsa-miR-342-3p;靶基因；基因本體;信號通路;生物信息學

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約在22個核苷酸(nt)左右，具有轉錄后水平調控功能的內源性非編碼單鏈小RNA分子[1]。研究證明,miRNA在轉錄或轉錄后水平上調節(jié)一部分信號分子參與細胞發(fā)育、分化、增殖凋亡和新陳代謝等多種生理過程[2]。miRNA-342-3p是一個被為廣泛研究的微小RNA分子，通過文獻分析表明其主要在腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌及結腸癌等癌癥中發(fā)揮抑癌作用[3-6]。hsa-miR-342-3p分子可能與細胞周期調控、DNA損傷修復等有關，但其具體作用靶標和信號通路，尚待深入研究。目前，miRNA靶標預測算法均需要運用到序列互補配對特性，熱力學穩(wěn)定性，及進化保守性等特征，聯(lián)合使用不同算法的靶標預測數(shù)據(jù)庫交叉預測可有效降低預測的假陽性率[7]。miRNA作用功能復雜，單一miRNA可有多個靶基因，目前研究預測每個 miRNA 將可能會調控 200 個左右的基因，而多個miRNAs也可交叉調控單一靶標。因此，有效預測miRNA靶基因并對其進行系統(tǒng)生物學分析是研究其作用機制的重要環(huán)節(jié)之一[8]。基于多算法交叉的靶標預測，結合靶標基因組織表達特異性等信息，可快速而有效地獲取靶基因信號通路和調控網絡等重要信息，并有可能挖掘得到潛在的生物學功能信息。本研究通過靶標預測，數(shù)據(jù)整理和信息分析,獲得相關重要信息，以期為進一步驗證hsa-miR-342-3p功能提供數(shù)據(jù)支持，為探索hsa-miR-342-3p在癌癥中的作用機制和生物學功能提供可能的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1　hsa-miR-342-3p特異性表達譜分析

利用Human MiRNA Expression Database (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/smallRNA/index.php)在線工具檢索獲得hsa-miR-342-3p在不同組織和疾病中的RPM(Reads Per Million reads)數(shù)據(jù)，獲得hsa-miR-342-3p在不同組織和疾病中特異性表達豐度信息，為靶基因組織和疾病定位及功能研究提供更多信息。

1.2　靶基因數(shù)據(jù)集獲得

利用 miRBase (http://www.mirbase.org/) 在線工具獲得hsa-miR-342-3p堿基序列、染色體定位和不同物種序列比對信息。分別使用TargetScan (http://www.targetscan.org)、Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和PITA(http://genie.weizmann.ac.il/)三種數(shù)據(jù)庫獲得hsa-miR-342-3p靶基因預測結果,提取靶基因GenBank ID或基因Symbol，并將其統(tǒng)一映射為GenBank ID，獲取三種預測結果的交集作為進一步分析的靶基因數(shù)據(jù)集。

1.3　靶基因功能及表達分析

檢索PubMed 關于hsa-miR-342-3p的相關研究，同時，提交靶基因至GeneCards(http://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫，獲取靶基因功能信息。使用Human-Bodymap (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-513/)在線數(shù)據(jù)庫獲得靶基因在疾病和組織中的特異性表達信息。

1.4　富集分析

基因本體GO(Gene Ontology)和代謝通路KEGG富集分析采用Bioconductor GOstats包完成[9]。GOstats作為Bioconductor項目重要的基因功能注釋和富集軟件,可完成基因產物所有的注釋,也可通過查詢單一GO術語得到具有這個注釋的所有基因產物。通過該軟件獲得靶基因的GO號及其層次分類注釋信息,包括細胞組分(Cellular component), 細胞分子功能(Molecular function, MF)和生物學過程(Biological process, BP)等。利用KEGG數(shù)據(jù)庫完成通路富集分析，對預測出的相關靶基因進行信號通路富集分析,并計算OR值和P值。

1.5　蛋白質互作網絡分析

將預測靶蛋白名稱列表提交至STRING(http://string-db.org/)蛋白質互作分析數(shù)據(jù)庫[10]，選擇物種為HumanSpecies，其它參數(shù)默認，執(zhí)行蛋白質相互作用網絡分析。

1.6　統(tǒng)計學分析

GO分析以高頻蛋白編碼基因為背景基因，采用超幾何分布方法計算P值，以P<0.05為相對于背景具有統(tǒng)計學意義閾值,得到基因集合在GO類別上的富集信息。KEGG富集的P值采用DAVID數(shù)據(jù)庫附帶的Fisher Exact Test軟件計算P值,以P<0.05為顯著性閾值,得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計學意義的信號通路。上述統(tǒng)計分析和計算均在Bioconductor3.0[11]平臺上完成。

2結果分析

2.1　hsa-miR-342-3p同源性分析

人類成熟hsa-miR-342-3p序列號為MIMAT0000753,位于14q32.2。通過對小鼠、大鼠、黑猩猩等5個哺乳物種的miR-342-3p序列分析，發(fā)現(xiàn)人類成熟hsa-miR-342-3p分子“42-ucucacacagaaaucgcacccgu-63”23個堿基在各個物種間高度保守,見表1。

表1不同物種中hsa-miR-342-3p的保守序列

Table 1Conserved sequence of hsa-miR-342-3p in different species

物種miRNA名稱保守序列人hsa-miR-342-3p42-ucucacacagaaaucgcacccgu-63小鼠mmu-miR-342-3p61-ucucacacagaaaucgcacccgu-83大鼠rno-miR-34261-ucucacacagaaaucgcacccgu-83黑猩猩ptr-miR-34260-ucucacacagaaaucgcacccgu-82獼猴mml-miR-34261-ucucacacagaaaucgcacccgu-83

2.2　hsa-miR-342-3p表達譜結果

Jing Gong 等[12]研究指出，人體不同組織樣本和疾病中大約70%的成熟 miRNAs 低表達或不表達 (RPM<1), 只有大約9% 的已知 miRNAs 處于相對高水平表達 (RPM≥100)。如圖1所示，利用HMED數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-342-3p在很多不同組織和疾病樣本中都高表達，特別是在急性淋巴細胞性白血病(ALL)、乳腺腫瘤(Breast tumor)及腎臟(Kidney)表達水平較高(RPM≥1 000)。

圖1　hsa-miR-342-3p 在不同組織和疾病中的平均表達水平Fig.1　Average expression level of hsa-miR-342-3p gene in different tissues and diseases

2.3　hsa-miR-342-3p靶基因預測

采用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫TargetScan、Pictar和PITA預測hsa-miR-342-3p靶基因，結果分別得到155、55和1 950個靶基因，取交集后共得到14個靶基因，如圖2所示, 靶基因信息如表2所示。

圖2　不同數(shù)據(jù)庫預測所得靶基因交集Fig.2　Intersection of prediction target genes using different database

序號GENBANK登錄號基因名稱基因官方名稱1NM_000945proteinphosphatase3(formerly2B),regulatorysubunitB,alphaisoformPPP3R12NM_001005609ectodysplasinAeda3NM_001204bonemorphogeneticproteinreceptor,typeII(serine/threoninekinase)bmpr24NM_001429E1Abindingproteinp300EP3005NM_001546inhibitorofDNAbinding4,dominantnegativehelix-loop-helixproteinid46NM_002442musashihomolog1(Drosophila)MSI17NM_003339ubiquitin-conjugatingenzymeE2D2(UBC4/5homolog,yeast)ube2d28NM_006206platelet-derivedgrowthfactorreceptor,alphapolypeptidepdgfra9NM_006549calcium/calmodulin-dependentproteinkinasekinase2,betacamkk210NM_017519ATrichinteractivedomain1B(SWI1-like)ARID1B11NM_019106septin3SEPT312NM_033296Mof4familyassociatedprotein1Mrfap113NM_173822familywithsequencesimilarity126,memberBFAM126B14NM_182398ribosomalproteinS6kinase,90kDa,polypeptide5RPS6KA5

2.4　靶基因功能研究

使用Human-Bodymap測序數(shù)據(jù)平臺，將靶基因名稱列表提交至服務器，分析得到靶基因在人體不同組織的特異表達譜。如圖3所示，SEPT3基因只在腦、淋巴結和睪丸中表達，且在腦中高表達；MSI1基因只在腦、結腸、卵巢、前列腺和睪丸組織中表達；EDA基因在腦組織、白細胞、肝臟和肌肉中不表達；RPS6KA5基因在脂肪組織、腎臟、肝臟中不表達。ID4在白細胞中不表達；MRFAP1、UBE2D2、PPP3R1、BMPR2、EP300、CAMKK2、ARID1B、FAM126B基因具有廣譜性表達特性。

圖3　靶基因在正常人體組織的特異性表達分布Fig.3　Specific expression of target genes in normal human tissues

2.5　GO富集分析

將上述14個靶基因的Gene IDs分別投射至GO兩大應用功能上，成功顯著映射到8個GO術語上，結果發(fā)現(xiàn)其中14個基因全部具有GO分子功能注釋信息，其功能主要富集于轉化生長因子活性、DNA結合、核染色質結合以及蛋白激酶活性等(P<0.005)；14個基因全部具有生物學過程注釋信息，顯著富集于肺部發(fā)育、呼吸系統(tǒng)發(fā)育、管狀組織發(fā)育及正向調控生物大分子代謝等(P<0.005)，結果分別見表3和表4。

表3　預測靶基因(部分)GO分子功能分類結果(P<0.005)

表4　預測靶基因GO生物學過程分類結果(P<0.005)

2.6　代謝通路富集分析

在GO注釋分類的基礎上，利用已有生物通路數(shù)據(jù)，對基因集合中的14個基因進行生物通路富集分析。如圖4結果顯示，在經典通路數(shù)據(jù)庫KEGG中hsa-miR-342-3p預測靶基因集合顯著富集于TGF-beta信號通路(P=0.000)，可能由膜上BMPRII受體介導信號轉導，下游通路主要有ID4蛋白負調控核轉錄因子及由EP300蛋白完成細胞周期G1期調控。此外，還顯著富集于細胞因子及受體相互作用網絡(P=0.006)以及前列腺癌疾病通路(P=0.008),結果見表5。

表5　預測靶基因KEGG 通路數(shù)據(jù)庫富集分析結果(P<0.05)

圖4　KEGG顯著富集的信號通路Fig.4　Significant enrichment of signal pathway using KEGG

2.7　蛋白質相互作用網絡分析

預測得到hsa-miR-342-3p靶基因總數(shù)14個，根據(jù)STRING蛋白質相互作用數(shù)據(jù)的信息可以構建蛋白質互作網絡，根據(jù)該網絡拓撲中度的重要性對靶基因進行排序。其中排在前五位的分別是“PPP3R1”,“PDGFRA”,“MSI1”,“RPS6KA5”,“EP300”。結果如圖5所示。

圖5　靶基因蛋白質互作網絡Fig.5　Interaction network of target protein

3討論

miRNA在許多生物學過程中發(fā)揮重要調控作用，人類三分之一基因由其調控,特別的，miRNA表達譜異常與癌癥疾病發(fā)生密切相關[13-14]。hsa-miR-342-3p序列在多物種間高度保守，且在多種組織和疾病中廣譜表達，提示其可能具有廣泛的生物學功能。采用信息學方法，系統(tǒng)分析靶標基因功能和信號通路,對豐富和深入研究hsa-miR-342-3p疾病調控機制具有重要意義。

本文交叉預測得到hsa-miR-342-3p靶基因總共有14個，尚未見文獻報道證實其相互作用。有關hsa-miR-342-3p表達譜研究已表明其在乳腺癌、腎癌等癌癥中高表達。hsa-miR-342-3p靶基因GO注釋主要富集在轉化生長因子活性、DNA結合、蛋白激酶活性等分子功能調控和呼吸系統(tǒng)發(fā)育、管狀組織建成等生物學過程中。KEGG可對某一miRNA諸多靶基因所涉及信號通路進行整合富集分析，本研究KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)hsa-miR-342-3p靶基因功能顯著富集于TGF-β信號通路、細胞因子信號通路以及前列腺癌疾病通路上。上述結果提示hsa-miR-342-3p不僅在脈管組織器官發(fā)育中起重要調控作用，而且可能通過靶向骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(BMRRII)而轉導參與TGF-β信號通路，并通過下游ID4蛋白和EP300蛋白參與DNA損傷修復和細胞周期調控，其具體作用機制有待進一步驗證。胞內轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路在胚胎的早期發(fā)育、免疫炎性反應、腫瘤以及機體代謝平衡中都扮演著非常重要的角色[15]。機體內TGF-β信號通路的激活受到非常精確的調控，研究其分子機制具有非常重要的基礎和應用意義。富集分析發(fā)現(xiàn)hsa-miR-342-3p靶向TGF-β信號通路組成蛋白,提示hsa-miR-342-3p可能通過調控TGF-β信號通路而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。

近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛參與了癌癥信號通路的調節(jié)，且與癌細胞的凋亡、轉移和浸潤密切相關[16，17]。hsa-miR-342-3p可能作為腫瘤抑制因子和激酶調控因子而參與癌癥病程。Wang等的研究表明hsa-miR-342-3p通過靶向DNA甲基化轉移酶DNMT而顯著抑制裸鼠結直腸癌細胞的生長與轉移[18]，Li等研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-342-3p的過度表達可抑制宮頸癌細胞系的增殖、遷移和侵襲[19]。Crippa E等研究發(fā)現(xiàn)過表達hsa-miR-342-3p可顯著降低ID4蛋白而提高乳腺癌抑制基因BRCA1的表達,抑制乳腺癌發(fā)展[20]。Ryan JL研究發(fā)現(xiàn)在EB(人類皰疹病毒病)感染人胃癌細胞后，會引發(fā)細胞周期調節(jié)因子ID4、血管生成因子HIF1a以及DNA修復因子BRCA1協(xié)同變化[21]。上述研究提示我們預測得到的hsa-miR-342-3p靶標ID4及下游分子響應網絡的存在。眾多miRNA受腫瘤抑制基因TP53激活而發(fā)揮轉錄后調控作用[22]。hsa-miR-342-3p靶標HIF1a和腫瘤抑制蛋白TP53存在密切相互作用，因此， hsa-miR-342-3p是否靶向ID4蛋白并協(xié)同HIF1a和TP53調控癌癥信號通路值得進一步實驗證實和深入研究。

4結論

通過生物信息學方法對hsa-miR-342-3p進行了系統(tǒng)的分析，結果顯示hsa-miR-342-3p在多種組織和疾病中表達，靶基因分布具有組織特異性，并可能通過調控多個靶基因而參與TGF-beta信號通路調節(jié),在機體的多種生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。hsa-miR-342-3p可作為結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌等管狀組織相關癌癥的生物標志性分子[23]，具有重要的研究價值。本文篩選預測得到的14個候選基因，為我們后續(xù)進一步探索hsa-miR-342-3p與癌癥機制方面提供了初步的研究方向。

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Bioinformatics analysis of hsa-miR-342-3p

MA Zhanbing1, 2，GENG Zhi1，JIAO Haiyan1, 2，HUO Zhenghao1, 2*

(1.DepartmentofMedicalGeneticsandCellBiology,SchoolofBasicMedicalScience,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China；

2.KeyLabofReproductionandGeneticsofNingxiaHuiAutonomousRegion,Yinchuan750004,China)

Abstract：To predict the target genes of the hsa-miR-342-3p and its function by bioinformatics analysis. All relevant studies of hsa-miR-342-3p were searched in PubMed and reviewed. The sequence of hsa-miR-342-3p was obtained from miRBase. TargetScan, Pictar and PITA were used to do intersection dataset of the target genes of hsa-miR-342-3p. The bioinformatics analysis of the target genes of hsa-miR-342-3p involved tissue and disease specific expression profile analysis,enrichment (gene ontology, GO), signal transduction pathway enrichment and protein interaction network analyses. The results showed that hsa-miR-342-3p sequences were highly conserved in various species. hsa-miR-342-3p had relatively high expression in kidney and disease of ALL, breast cancer (RPM≥1 000). There were 14 target genes of hsa-miR-342-3p identified. GO analyses showed that hsa-miR-342-3p target genes were enriched in growth factor activity, DNA binding and protein kinase activity (GO molecular function，P<0.05)，and enriched in positive regulation of macromolecule metabolic process, lung development, tube development and respiratory tube development (GO biology process，P<0.05); Pathway analyses showed that the target genes set mainly located in TGF-Beta signaling pathway, cytokine-cytokine receptor interaction signaling pathway and prostate disease pathway (P<0.01).The conclusion is hsa-miR-342-3p may be involved in the diseases via TGF-Beta signaling pathway, which might be a potential biological marker for further investigation.

Keywords：Hsa-miR-342-3p; Target genes; Gene ontology; Pathway; Bioinformatics

中圖分類號：Q343.1

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2015)04-212-08

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2015.04.02

作者簡介：馬占兵，男，助教，研究方向:復雜疾病遺傳;E-mail:mabing_516@163.com.*通信作者：霍正浩,男，教授，研究方向:人類群體遺傳學; E-mail:huozhh@163.com.

基金項目：寧夏醫(yī)科大學2014年度校級科研項目(XM201401)。

收稿日期：2015-10-31;修回日期：2015-11-15.