阻斷淀粉樣前體蛋白-C端片段毒性通路對Cofilin磷酸化的影響

陳　慧，許妍姬

(延邊大學醫學院 預防醫學教研室,吉林 延吉133000)

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阻斷淀粉樣前體蛋白-C端片段毒性通路對Cofilin磷酸化的影響

陳慧，許妍姬*

(延邊大學醫學院 預防醫學教研室,吉林 延吉133000)

摘要：目的本研究欲探討阻斷淀粉樣前體蛋白-C端片段(Amyloid Precursor Protein C Terminal Fragments，APP-CTFs)毒性通路對Cofilin磷酸化的影響方法大鼠胚鼠大腦皮層神經元細胞培養，采取3種方法阻斷APP-CTFs毒性通路。①APP-695轉染后γ-內切酶抑制劑DAPT處理②利用YENPTY段刪除的pEGFP-APP C99,C57轉染至大鼠神經元細胞③GSK-3β抑制劑LiCl處理，3種方法阻斷后，均采用蛋白印跡方法檢測Ph-cofilin蛋白水平。結果DAPT處理組與未處理組比較Ph-cofilin蛋白表達水平降低(P<0.05)。轉染YENPTY段刪除的pEGFP-APP CTFs組未能明顯增強磷酸化Cofilin的蛋白表達水平(P>0.05)，雖然轉染APP-CT99,57-pEGFP組與空載體對照組相比較，Ph-Cofilin蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)。LiCl處理組與非處理組相比，Ph-Cofilin蛋白表達無明顯改變(P>0.05)。結論提示APP-CTFs誘導的Cofilin磷酸化過程與APP-CTFs核轉移毒性通路有關,但與其誘導的GSK-3β-Tau毒性通路無關。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1045)

到目前為止AD病的病因及發病機制尚不清楚，目前仍缺乏特異的治療方法，因此世界各國醫藥界對AD的研究尤為重視，該領域已成為當今世界研究的熱點[1]。研究AD的分子機制以尋找新的靶點是抗AD藥物開發的集中所在。AD有各種發病假說，如膽堿能功能低下假說，炎癥或免疫假說，基因突變假說，淀粉樣蛋白假說，氧化應激及興奮性毒性假說，凋亡假說等。其中淀粉樣蛋白假說一直很受重視。最近淀粉樣前體蛋白C端片段在發病機制里起重要作用的報道很多。淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)依次經α-，β-，γ-分泌酶水解后形成不同長度C端片段APP-CTFs，APP-CTFs的毒性機制貢獻于AD。其毒性機制是被各種酶切之后形成的AICD與Fe65結合進行核轉移,后與CP2/LSF/LBP1轉錄因子結合刺激GSK-3β基因，增強Tau磷酸化[2-5]。

AD腦組織除老年斑和神經元纖維纏結之外，還包含Hirano bodies,是由肌動蛋白和其結合蛋白cofilin構成的節狀結構[6-8]。老年性癡呆患者的腦皮質和海馬回中發現的ADF/cofilin-肌動蛋白節狀結構，在正常人腦中沒有[9]。

我們在先前的研究中已發現APP-CTF轉染可以使磷酸化-cofilin水平增高。此次我們想阻斷APP-CTFs毒性通路對Cofilin磷酸化的影響。采取3種方法阻斷APP-CTFs毒性通路。①APP-695轉染后γ-內切酶抑制劑DAPT處理，阻斷APP-CTF的產生②利用YENPTY段刪除的pEGFP-APP C99,C57轉染，阻斷APP-CTF核內毒性通路。③處理GSK-3β抑制劑LiCl，阻斷APP-CTF導致的Tau毒性通路。3種通路阻斷后，均采用蛋白印跡方法檢測Ph-cofilin蛋白水平。本研究在分子機制水平上更深層次地探討APP-CTFs對cofilin基因表達的影響，可為AD的發病機制提供一個新的不同的毒性通路。

1材料與方法

1.1　材料

APP-CTFs[5]由韓國首爾醫科大學藥理學教室徐維憲教授饋贈。

1.1.1藥品與試劑胰蛋白酶(Sigma)；胎牛血清(Corning,N.Y,14831,USA)；DMEM培養液(Grand Island,N.Y,14072,USA)；Ph-cofilin和tubulin免疫染色抗體購于德國默克密理博公司；10%DF培養液由本實驗室自配；NDiff Neuro-2(N2)培養基補充劑購于德國默克密理博公司；DMEM培養液購自Grand Island,N.Y,14072,USA；Lipofectamine 2000從invitrogen公司購買；辣根過氧化物山羊抗兔(抗屬)抗體，以及相應WB封閉液、洗滌液、一抗二抗稀釋液均從碧云天生物科技公司購買；胎牛血清；馬血清；SPF級SD大鼠由延邊大學動物科學實驗中心飼養提供。

1.1.2實驗儀器蛋白印跡電泳(轉膜)裝置、分析天平、生物顯微鏡、低高速容量離心機、恒溫水浴鍋、恒溫CO2培養箱、立式壓力蒸汽滅菌器、制冰機、移液器等均由延邊大學醫學院預防醫學實驗中心提供。

1.2　實驗方法

1.2.1質粒的擴增、提取和純化分別將含有重組質粒pEGFP-N1-APLP2-CTFs(C57,C99)[5]和空載體pEGFP-N1的菌種用Kan+培養基培養并選取單菌落，取單菌落至10 ml含Kan+的LB液體培養基中，于37℃、230 r/min振蕩培養過夜，再轉入200 ml LB液體培養基中擴大培養。按照質粒大量提取試劑盒說明提取、純化質粒，并用紫外分光光度計測定質粒的濃度和純度。

1.2.2胚胎神經元細胞培養選擇懷孕16-18天的大鼠將其用乙醚麻醉，解剖腹部取出胚胎放入預冷的D-hank’s液中。剪開胚胎，取出仔鼠，用剪刀輕輕剪開顱骨，剝離掉最上層的腦膜后，直接取大腦皮層組織(此過程在超凈臺操作)；將組織剪成約1 mm×1 mm塊狀并放置于新的D-hank’s液中離心；去上清液后的組織再加入0.25%的胰酶消化分解，于37 ℃水浴20 min。最后把消化過的組織用200目篩網進一步碾碎過篩，得到神經元細胞。

預先用含0.1%的多聚賴氨酸溶液包埋在蓋玻片上，促使神經元細胞貼壁生長。剛獲得的神經元細胞用含5%的馬血清，10%胎牛血清的DMEM培養液，在5%濃度的CO2，37℃恒溫培養箱中培養；第二天換成含有1%的N2的DMEM培養液培養，第四天再更換含有5%的馬血清，10%胎牛血清的DMEM培養液，5-7天進行做后續處理。

1.2.3質粒的轉染實驗分為3個組，①對照組轉染pEGFP-N1空載體②APP-CTs轉染組③突變型APP-CTs轉染組

1.2.4Western印跡方法檢測ph-cofilin蛋白水平用預冷的PBS清洗細胞，加入RIPA裂解液，在冰上用細胞刮裂解細胞，收集細胞，4℃ 6 000 g rpm 離心5分鐘，得出細胞裂解液，蛋白定量，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，用封閉液封閉1 h，用活化的ph-cofilin單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜， 洗滌液漂洗3次后加二抗辣根氧化酶(HRP)-IgG(1∶1000),室溫孵育1 h,洗膜三次后化學發光法顯色。用紫外分光光度計掃描條帶灰度值，β-actin作為內參照，計算蛋白質表達水平。

2結果

2.1DAPT處理對ph-cofilin蛋白表達的影響為了探究APP-CTFs的產生對Cofilin磷酸化的影響，我們轉染APP-695 整長度(FL，Fulllength)cDNA后，處理DAPT。DAPT是γ-內切酶的抑制劑，可以抑制APP-CTFs的產生。實驗結果顯示加入DAPT處理與非處理組相比較，磷酸化Cofilin的蛋白表達水平下降(P<0.05，圖1)

2.2　轉染突變型APP-CTFs對ph-cofilin蛋白表達的影響

為了探究APP-CTFs誘導的Cofilin磷酸化過程是否與APP-CTFs的核轉移毒性通路有關。我們轉染了YENPTY段刪除的pEGFP-APPC99、C57轉染至大鼠神經元細胞，觀察了磷酸化Cofilin的蛋白表達水平。結果轉染YENPTY段刪除的pEGFP-APP CTFs組未能明顯增強磷酸化Cofilin的蛋白表達水平，與空載體對照組相比較無顯著性差異(P>0.05，圖2)。雖然轉染APP-CT99,57-pEGFP組與空載體對照組相比較，Ph-Cofilin蛋白表達水平明顯增加。(P<0.05，圖2)

圖1DAPT處理對磷酸化-cofilin蛋白表達的影響轉染APP-695整長度(FL,Full length)cDNA后，處理DAPT.DAPT是γ-內切酶的抑制劑，可以抑制APP-CTFs的產生.每組實驗數據來自3次實驗，進行了配對T-檢驗.

圖2轉染突變型APP-CTFs(#CT)對磷酸化-cofilin蛋白表達的影響轉染YENPTY段刪除的pEGFP-APP C99、C57至大鼠胚鼠大腦皮層神經元細胞

2.3　LiCl處理對ph-cofilin蛋白表達的影響

為了探究APP-CTFs誘導的Cofilin磷酸化過程是否與APP-CTFs的GSK-3β-Tau毒性通路有關。我們選擇了GSK-3β抑制劑LiCl。轉染APP-CTFs基因片段后，處理10mM LiCl，結果LiCl處理組與非處理組相比，Ph-Cofilin蛋白表達無明顯改變。(P>0.05，圖3)

圖3LiCl處理對APP-CTFs誘導磷酸化-cofilin蛋白表達的影響大鼠胚鼠大腦皮層神經元細胞轉染APP-CTFs之前，預處理10 mM LiCl,LiCl是GSK-3β抑制劑.

3討論

老年性癡呆(阿爾茨海默病，Alzheimer disease,AD)患者病理典型變化是腦中老年斑(Senileplaque)和細胞內神經元纖維纏結(NFT)。淀粉樣前體蛋白(APP)先后經β分泌酶和γ分泌酶的剪切之后，產生了Aβ和不同長度的APP-C端游離片段。最近，APP-CTFs在AD的發病機制里也起重要作用的報道很多[1-3]。淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)依次經α-，β-，γ-分泌酶水解后形成不同長度C端片段APP-CTFs，APP-CTFs的毒性機制貢獻于AD。其毒性機制是被各種酶切之后形成的AICD與Fe65結合進行核轉移,后與CP2/LSF/LBP1轉錄因子結合刺激GSK-3β基因，增強Tau磷酸化[2-5]

Cofilin是ADF蛋白家族成員，老年性癡呆與cofilin家族表達變化有關[10-12，18]。最近研究表明，異常的cofilin沉積可引起Tau神經氈螺紋(neuropil threads),所以提示cofilin-肌動蛋白束在AD病理機制中可能引起重要作用。但cofilin-肌動蛋白節狀結構形成的具體機制還未闡明[10-12]。Aβ誘導的退行性變化，通過LIM-激酶對ADF/cofilin-脫磷酸化來實行，闡明老年性癡呆神經營養不良的潛在性機制[13]。

我們在先前的研究中已發現APP-CTF轉染可以使磷酸化-cofilin水平增高。此次我們想阻斷APP-CTFs毒性通路對Cofilin磷酸化的影響。采取三種方法阻斷APP-CTFs毒性通路。首先，轉染APP-695 整長度(FL，Full length)cDNA 后，γ-內切酶的抑制劑DAPT處理后觀察了對ph-cofilin蛋白表達的影響。結果DAPT處理與非處理組相比較，磷酸化Cofilin的蛋白表達水平下降(P<0.05，圖1)，說明APP-CTFs的產生對Cofilin磷酸化過程是重要的環節。

其次，為了探究APP-CTFs誘導的Cofilin磷酸化過程是否與APP-CTFs的核轉移毒性通路有關。轉染YENPTY段刪除的pEGFP-APP CTFs組未能明顯增強磷酸化Cofilin的蛋白表達水平(P>0.05，圖2)，雖然轉染APP-CT99,57-pEGFP組與空載體對照組相比較，Ph-Cofilin蛋白表達水平明顯增加(P<0.05，圖2)。提示APP-CTFs誘導的Cofilin磷酸化過程與APP-CTFs的核轉移毒性通路有關。最近研究表明Cofilin蛋白有核進入和輸出信號，況且這些信號作用于在應激壓力狀態下可以形成適當的rod 結構[15]。其它的HD(Huntington disease,亨廷頓病性癡呆)疾病這些cofilin-肌動蛋白節狀(actin rod)結構被假設成有潛在的生理作用和假如被調控為結構紊亂時可以增加患神經變性性疾病的罹患率[16]。APP-CTFs和Cofilin核轉移和相互作用的進一步分子生物學機制有待于進一步研究。

最后，為了探究APP-CTFs誘導的Cofilin磷酸化過程是否與APP-CTFs的GSK-3β-Tau毒性通路有關。我們選擇了GSK-3β抑制劑LiCl。結果LiCl處理組與非處理組相比，Ph-Cofilin蛋白表達無明顯改變。(P>0.05，圖3)提示APP-CTFs誘導的Cofilin磷酸化過程與APP-CTFs誘導的GSK-3β-Tau毒性通路無關。也有報道cofilin-肌動蛋白節狀(actin rod)結構的蓄積可以延伸tau病理變化[17]，況且這些變化與患者的年齡是無關的。APP-CTFs誘導的Cofilin磷酸化過程與Tau毒性通路之間的詳細的分子生物學機制也有待于再研究。

本研究在分子機制水平上更深層次地探討APP-CTFs對cofilin基因表達的影響，可為AD的發病機制提示一個新的不同的毒性通路，其具體更深的分子生物學機制有待于進一步研究探討。

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關鍵詞：APP- C端片段；Cofilin；DPAT,YENPTY,LICl

Effect of blocking toxicity pathways of C-terminal Fragment of Amyloid Precursor Protein on ADF/Cofilin in rat primary neuronal culture cellsCHENHui,XUYan-ji.(DepartmentofPreventiveMedicine,MedicalCollegeYanbianUniversity,Yanji,Jilin133000,China)

Abstract:ObjectiveIn this study,we aim to eluciate the effects of blocking toxicity pathways of APP-CTFs on cofilin phosphorylationMethodsrat primary neuronal cells were cultured and choosed three different blocking toxicity pathways of APP-CTFs.①transfected with APP-695 Full length cDNA,and treated with an inhibitor of γ-secretase,DAPT②transfected with deletion of YENPTY domain of APP-CTFs.③treated with an inhibitor of GSK-3β,LiCl.ResultsAs an inhibitor of γ-secretase,DAPT treatment decreased the phospho-cofilin (Ph-cofilin) protein levels in the transfected group with a full length of APP-695.When transfected with the deletion of the YENPTY domain of mutated APP-CTFs,Ph-cofilin did not have any significant increase.As an inhibitor of GSK-3β,LiCl treatment did not block the APP-CTFs that induced cofilin phosphorylation.ConclusionIndicating that this may be related to the translocation of the nucleus pathway; but not mediated by the GSK-3β pathway.

Key words:APP；cofilin; C-terminal Fragment; DPAT;YENPTY;LICl

(收稿日期：2015-03-15)

作者簡介：許妍姬(1973-),女,朝鮮族，博士，副教授,主要從事神經毒理學研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：TQ93

文章編號：1007-4287(2015)07-1045-05

*通訊作者

基金項目：國家自然科學基金(81160159)