外周血CD4+CD25+CD127low調節性T細胞在惡性腫瘤患者免疫功能評估中的作用

姜艷麗,劉　磊,王雪野*,劉龑航

(1.吉林省人民醫院 腫瘤科;2.吉林省人民醫院 腫瘤生物治療中心，吉林 長春130021)

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外周血CD4+CD25+CD127low調節性T細胞在惡性腫瘤患者免疫功能評估中的作用

姜艷麗1,劉磊2,王雪野1*,劉龑航1

(1.吉林省人民醫院 腫瘤科;2.吉林省人民醫院 腫瘤生物治療中心，吉林 長春130021)

摘要：目的觀察惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127low調節性T細胞(CD4+CD25+CD127lowTreg)的數量變化，探討外周血CD4+CD25+CD127lowTreg檢測在惡性腫瘤患者免疫功能評估中的作用。方法以35例正常人作為對照組，采用流式細胞術檢測74例腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg在CD4+T細胞的比例，分析不同TNM分期惡性腫瘤患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細胞的百分比，采用實時熒光定量RT-PCR技術檢測PBMC轉錄因子Foxp3表達水平。結果腫瘤患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細胞百分比為(6.19±1.82)%，明顯高于對照組(3.12±1.16)%，差異具有統計學意義(P<0.05)。其中Ⅲ、Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分比分別為(6.08±2.14)%、(6.88±2.65)%，明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者(5.65±1.86)%，P<0.05；病理分型為低分化者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比為(6.72±2.60)%，明顯高于高分化者(5.94±2.11)%，P<0.05；有淋巴結轉移者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比為(6.95±3.12)%，明顯高于無淋巴結轉移者(5.02±2.09)%，P<0.05。結論惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細胞的比例明顯升高，監測CD4+CD25+CD127lowTreg有利于評估腫瘤患者的免疫功能和輔助判斷腫瘤患者的病情進展及預后。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1117)

免疫功能的評估對于掌握腫瘤患者的最佳治療時機和制定合理的診療方案，評價治療的效果均具有重要意義。T細胞介導的細胞免疫功能是機體抗腫瘤免疫的主要方式，外周血中CD4和CD8兩類T細胞亞群的相互制約維系著機體免疫系統的平衡。研究發現，腫瘤患者常表現為T細胞亞群比例失調，免疫抑制因子的升高和或免疫促進分子表達水平的降低[1,2]。我們觀察發現，CD4+CD25+Treg細胞在腫瘤患者中比例顯著增加，CD4+CD25+Treg細胞比例的下調有助于提供機體的抗腫瘤效應和利于腫瘤的治療效果[3]。Foxp3被認為CD4+CD25+Treg細胞的重要標記物，因其在細胞內表達，因而需要對細胞固定和穿孔后才能堅定，降低其的臨床實用性。CD127的表達與Foxp3成負相關，被證實可以替代Foxp3成為Treg細胞的特異性標志物。本研究采用流式細胞儀分析惡性腫瘤患者CD4+CD25+CD127lowTreg表達情況，探討其在腫瘤臨床診療和免疫評估的重要意義。

1材料和方法

1.1臨床資料實驗組為本院2012年3月-2014年4月門診或住院的74例惡性腫瘤患者，男43例， 女31例，年齡20 -81歲，中位年齡52歲，所有病例均經病理診斷證實，臨床分期根據國際抗癌協會標準，其中肺癌15例，原發性肝癌19例,胃癌16例，結直腸腫瘤12例,乳腺癌7例，卵巢癌5例。其中Ⅰ-Ⅱ期42例、Ⅲ期17例、Ⅳ期15例；所有患者未經過抗腫瘤化療及免疫治療。對照組35例，為本院體檢的健康成人，其中男19例，女16例，年齡26-70歲，中位年齡45歲。

1.2主要試劑及儀器鼠抗人單克隆抗體CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，同型對照IgG1、IgG2、紅細胞裂解液、流式細胞儀(EPICS XL)購自美國貝克曼庫爾特公司；PCR擴增引物由北京鼎國公司合成， SYBR Green試劑購于廣州達安基因公司，ABI Prism 7500熒光定量PCR儀器。

1.3外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例檢測所有被觀察對象均于清晨空腹采集靜脈血2 ml，經EDTA-2K抗凝，使用直接免疫熒光標記法標記細胞并進行流式細胞儀分析。操作步驟：取單克隆抗體CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE及同型對照各20 μl，加入100 μl EDTA-2K抗凝的外周血，室溫下避光孵育15 min，再加入紅細胞裂解液500 μl，避光孵育10 min；加入PBS洗2次，離心1500轉，5 min，棄上清后加入適量的PBS，上機檢測。

1.4Foxp3 mRNA的熒光定量PCR檢測上游引物為5’-GTGGCATCATCCGACAAGG-3’；下游引物為5’-TGTGGAGGAACTCTGGGAAT-3’。 TRIZOL Reagent提取PBMC總RNA。參照AMV Reverse transcriptase說明方法將總RNA合成cDNA。應用SYBR Green嵌合熒光法進行Real-Time PCR檢測，以GADPH作為內參對照，同一cDNA模板均在同一反應條件下行3次重復實驗，結果采用2-ΔΔCT的數據統計方法。

2結果

2.1　外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例

流式細胞儀檢測分析顯示(圖1，表1),腫瘤患者治療前外周血CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細胞的比率為(6.19±1.82)%，顯著高于健康對照組(3.12±1.16)%，差異具有統計學意義(P<0.05)。進一步對數據進行分析顯示，Ⅲ、Ⅳ期腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分比分別為(6.08±2.14)%、(6.88±2.65)%，明顯高于Ⅰ-Ⅱ期腫瘤患者(5.65±1.86)%，P<0.05。病理分型為低分化者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例為(6.72±2.60)%，明顯高于高分化者(5.94±2.11)%，P<0.05；有淋巴結轉移的患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例為(6.95±3.12)%，明顯高于無淋巴結轉移者(5.02±2.09)%，P<0.05。

圖1　外周血CD4+CD25+CD127lowTreg流式分析圖

組別nCD4+CD2+CD127low/CD4+T(%)P值正常對照組353.12±1.16P<0.05腫瘤患者746.19±1.82腫瘤分期 Ⅰ-Ⅱ期425.65±1.86P<0.05 Ⅲ期176.08±2.14 Ⅳ期156.88±2.65分化程度 中、高度分化315.94±2.11P<0.05 低分化436.72±2.60淋巴轉移 無轉移575.02±2.09P<0.05 有轉移176.95±3.12

2.2　外周血PBMC中轉錄因子Foxp3表達變化

腫瘤患者外周血PBMC中轉錄因子Foxp3表達與正常組相比均顯著增高(P<0.05)，其中Ⅳ期腫瘤癌患者組Foxp3增高最明顯(P<0.01)，見圖2。

圖2　PMBC中Foxp3 mRNA的相對表達量

3討論

研究發現，腫瘤患者常處于免疫功能低下狀態，腫瘤發生時常伴有外周血中CD4+CD25+Tergs誘導性增高。CD4+CD25+Tregs可抑制機體的抗腫瘤免疫反應，減弱或抑制疫苗誘導的抗腫瘤免疫作用，參與腫瘤免疫逃逸[4]。我們前期對61例的腫瘤患者評估研究中證實[5]，CD4+CD25+Treg的變化與腫瘤的分期密切相關，是導致腫瘤進展重要的因素。

缺乏理想的特異性標記是限制研究CD4+CD25+Treg檢測及分析的最大障礙。CD4+CD25+Treg因為不能包含與活化T細胞重合的那一部分CD4+CD25+Treg，所以不能完全涵蓋人體內調節性T細胞[6]。叉頭/翼狀螺旋轉錄因子Foxp3是CD4+CD25+Treg在胸腺內發育和功能維持所必需，被認為是CD4+CD25+Treg的理想標記[7]。本研究利用熒光定量PCR技術檢測腫瘤患者PBMC中Foxp3的mRNA發現，腫瘤患者PBMC中轉錄因子Foxp3表達與正常組相比均顯著增高(P<0.05)，其中Ⅳ期腫瘤癌患者組Foxp3增高最降明顯(P<0.05)，可以作為一種良好的標記物輔助評估CD4+CD25+Treg的比例和腫瘤的免疫功能。但由于Foxp3表達于細胞內，FoxP3標記后的細胞已被破壞，不利于對調節性T細胞做進一步的培養和研究工作[8]。CD127分子被證實在Treg細胞表面呈現低表達并且與Foxp3的表達成負相關，在CD4+CD25+基礎上聯合CD127抗原可以更好地識別人CD4+CD25+Treg[9]。本研究在對74例惡性腫瘤患者的外周血CD4+CD25+CD127lowTreg含量的分析證實，CD4+CD25+CD127lowTreg可以較好的評估腫瘤患者的機體免疫功能，其在不同類型的腫瘤患者均呈現出較健康人群較高的表達水平，與文獻報道結果基本一致[10-12]。同時我們在對腫瘤的不同分期中的檢測發現，CD4+CD25+CD127lowTreg表現出差異性表達(P<0.05)，隨著腫瘤的進展，機體免疫功能逐漸降低，與我們前期證實的利用CD4+CD25+Treg評估腫瘤的免疫功能呈現出良好的相關性[3]。

綜上，CD4+CD25+CD127lowTreg的數量可以作為評價腫瘤的發生發展的重要監測指標。通過分析CD4+CD25+CD127lowTreg可以更好的評估和分析其機體免疫調節中的作用。CD4+CD25+CD127lowTreg同時又可以作為臨床上一種靶點，為抗腫瘤免疫提供新的治療途徑。

參考文獻：

[1]林澤偉，駱必偉，袁曉東，等.原發性肝癌患者腫瘤浸潤T淋巴細胞亞群分析[J].中國現代普通外科進展，2013，16(07)：523,541.

[2]劉劍，顧棟樺.大腸腺癌組織中肺癌腫瘤抑制因子-1的表達與臨床預后及其基因甲基化的關系[J].中華實驗外科雜志，2014，31(03)：644.

[3]王雪野，韓梅，陳琳，等.胃癌患者外周血CD4+CD25highFoxp3+調節性T細胞的檢測及臨床意義[J].中國免疫學雜志 2009，25(05)：459,467.

[4]閻永貞.腫瘤免疫逃逸機制的研究進展[J].復旦學報(醫學版)，2013，40(05)：619.

[5]王雪野,韓梅,高長斌，等.惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25highFoxp3+調節性T細胞的檢測及臨床意義[J].吉林大學學報(醫學版)，2009，35(02)：373.

[6]王會平,翟志敏,張愛梅，等.CD4+CD25+CDl27low識別人外周血CD4+CD25+調節性T細胞的優勢[J].中國免疫學雜志，2008，24，(12)：1059.

[7]Yamamoto T,Yanagimoto H,Satoi S,et,al.Circulating CD4+CD25+regulatory T cells in patients with pancreatic cancer[J].Pancreas,2012 ,41(3):409.

[8]Sun Q,Zhang Q,Xiao H,et,al.Significance of the frequency of CD4+CD25+CD127- T-cells in patients with pulmonary tuberculosis and diabetes mellitus[J].Respirology，2012，17(5):876.

[9]Liu W,Putnam AL,Xu-Yu Z,et,al.CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ Treg cells [J].J Exp Med,2006,，203(7):1701.

[10]Si TG,Wang JP,Guo Z.Analysis of circulating regulatory T cells (CD4+CD25+CD127-) after cryosurgery in prostate cancer[J].Asian J Androl,2013 ,15(4):461.

[11]荊結線,喬麗娟,郭愛芝，等.卵巢癌患者外周血CD4+CD25hiCD127lo調節性T細胞格局變化及臨床意義[J].中國免疫學雜志，2012，28(01):49.

[12]賈莉婷,榮守華,泰淑紅，等.CD4+CD25highCD127low調節性T細胞在宮頸癌患者外周血中的表達及意義[J].中國婦幼保健，2010，25(11)：1553.

關鍵詞：腫瘤；CD4+CD25+CD127low調節性T細胞；流式細胞術

Expression levels of CD4+CD25+CD127lowregulatory T-cell characterize different populations in human peripheral blood with CancerJIANGYan-li1,LIULei2,WANGXue-ye1*.(1.OncologyDepartmentofJilinProvinceHospital；2.TumorbiotherapycenterofJilinProvinceHospital,Changchun130021，China)

Abstract:ObjectiveThis study is assigned to investigate the changes of CD4+CD25+CD127lowTreg in peripheral blood from cancer patients and explore its clinical significance.MethodsThe proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg in CD4+T cells in peripheral blood were measured by flow cytometry in 74 tumor patients and 35 cases of normal people as control .Foxp3 expression were determined by quantitative real?time PCR.ResultsThe ratio of CD4+CD25+CD127lowTreg in CD4+T cell of tumor patients (6.19±1.82%) was obviously higher than that in the healthy control group (3.12±1.16%),the difference was statistically significant (P<0.05).Peripheral blood CD4+CD25+CD127lowTreg level is significantly higher ratio in patients with stage Ⅲ (6.08±2.14%) and stage IV(6.88±2.65%) than that in stage Ⅰ-Ⅱ(5.65±1.86%),P<0.05.With pathological classification，CD4+CD25+CD127lowTreg level in the poorly differentiated is higher than that in the high differentiated(6.72±2.60% vs 5.94±2.11,P<0.05).CD4+CD25+CD127lowTreg level in the patients who got lymph node metastasis is higher than that in the patients who didn’t get lymph node metastasis(6.95±3.12% vs 5.02±2.09%，P<0.05).ConclusionThe proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg in peripheral blood of tumor patients increased significantly and was related to tumor progression.CD4+CD25+CD127lowTreg would help evaluate the immune function of cancer patients.

Key words:tumor；CD4+CD25+CD127lowTreg；FACS

(收稿日期：2014-08-20)

作者簡介：姜艷麗(1978-)，女，醫學碩士，主治醫師，主要從事腫瘤免疫相關研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：R730

文章編號：1007-4287(2015)07-1117-04

*通訊作者

基金項目：吉林省科技廳自然科學基金(編號：201115201)；吉林省衛生廳項目(編號：2011Z074)