β>3腎上腺素能受體基因多態性與冠心病發病相關性的研究

?

β>3腎上腺素能受體基因多態性與冠心病發病相關性的研究

劉永生1,韓洪波2,趙佳輝1

(1.解放軍第208醫院 心內科，吉林 長春130062；2.解放軍第208醫院 內分泌科)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是由于冠狀動脈器質性和/或功能性病變引發的冠狀動脈供血與心肌耗氧量間的供需矛盾而導致的心肌缺氧損害。本病系病死率極高的疾病之一，已被公認為是人類健康的殺手。可見如何對冠心病做到早診斷、早治療、早預防是我們目前需要攻克的醫學難關。但目前冠心病的病因并未被完全闡明，其病因復雜，是先天遺傳物質基礎與后天飲食、代謝、運動等生活習慣因素長期相互做用而引發的這一觀點已得到公認。在后天生活習慣等因素在防治冠心病被強調的同時，人們同樣渴望在基因水平探討出冠心病的發病相關因素。一些與脂代謝密切相關的基因已經成為本病的候選基因而被作為針對本病病因的研究熱點。腎上腺素能受體在冠心病的病因研究中一直占較重位置，繼β1-AR與心肌耗氧量及β2-AR與血管損傷被廣泛研究后，β3-AR已被重視并深入研究，曾有研究表明β3-AR可以介導脂肪代謝相關反應，使之分解生熱[1]，也有學者稱此受體基因變異能夠導致脂代謝異常及肥胖，而如上兩條均為冠心病發病的高危因素，鑒于此，β3-AR基因進入了冠心病發病的重要候選基因群。對于β3-AR基因的多態性研究較多的是此基因第一外顯子的第190位點多態性，此基因位點野生型的T可以突變為C，本實驗針對這一位點的多態性進行了一系列研究，從所得數據分析此位點多態性與冠心病的發病及病情輕重的相關性，報道如下。

1材料與方法

1.1研究對象冠心病組：選自于解放軍208醫院就診的患者，就診時段為2009年2月-2014年5月，入選患者均經冠狀動脈造影確診的冠心病患者131人，其中男性69人，女性62人，年齡為50.12±6.95。健康中老年人組系同期于解放軍208醫院門診體檢或住院的中老年人，經320排CT或冠狀動脈造影檢查排除冠心病，經隨機選取所得實驗對象共計125人，其中男性66人，女性59人，年齡為52.13±7.54。以上兩組實驗對象年齡及性別比例均經統計學檢驗顯示組間呈現匹配關系。冠心病患者131人按冠狀動脈造影結果行SYNTAX評分[2]分為3組，分組相關詳細數據見表1。

表1　冠心病組按SYNTAX評分分組情況

以上3組實驗對象的性別比例、年齡經統計學檢驗顯示各組間呈現匹配關系。所有實驗對象血常規、肝功能及腎功能均正常，需排除肝、腎疾病。糖尿病患者為本實驗排除對象。所有實驗對象均為漢族，且各實驗對象間無血緣關系。

1．2制備模板DNA 實驗對象均晨起時采集空腹靜脈血4 ml，抗凝劑用EDTA-K2，參照文獻中所講的碘化鈉裂解、戊醇及氯仿提取法[3]經白細胞提取基因組DNA，所提取DNA-30℃保存。

1．3引物合成引物設計均參照文獻[4]，針對β3-AR基因第一外顯子的一個片段，此片段中包含第190位點及其上下游的相關DNA序列。(兩引物均由上海生工生物工程有限公司合成)上游引物為：5′-CGCCCAATACCGCCAACA-3′下游引物為：5′-CCACCAGGA GTCCCATCACC-3′。

1．4擴增條件及反應體系本實驗PCR體系25 μl ，體系含DNA模板100 ng，2.5 μl 10×PCR緩沖液，Taq酶2.5 U (上海生工生物工程有限公司生產)，15 mmol/L dNTPs 0.5 μl ，引物上、下游各2 μl。反應條件：預變性96℃5 min，此后95℃、55℃、72℃各40 S，循環30次，延伸溫度72℃，時間10 min，保存溫度為4℃。所用PCR儀為Primus25型。

1．5限制性酶切條件取5 μl前述實驗所得PCR擴增產物，在37℃下用BstNI 10U酶切作用7 h。反應完成后，如上酶切產物在120 V 電壓下于3%瓊脂糖凝膠電泳6 h，電泳后EB染色，此后以長度DL100DNA為標準進行參照分析，結果需在紫外燈下判斷，拍照留存。

1．6統計學方法采用組間直接對比分析法，計算各基因型及等位基因頻率在人群中所占百分比，不同組間等位基因頻率對比用χ2檢驗，所用軟件包為SPSS13.0。組間具有顯著性差異的標準為P<0.05。

2結果

2．1β3-AR基因第一外顯子190位點分析PCR擴增產物大小為210 bp，此擴增產物包含待測位點及其上下游的一段DNA序列，此位點T/C突變發生后可使原有的一個BstNI限制性酶切位點消失，據此以BstNI酶切擴增產物后分析。基因型共有3種：正常純合子TT型可得酶切產物為5條帶(99、62、30、12、7 bp)，突變雜合子TC型為6條帶(161、99、62、30、12、7 bp)，突變純合子CC為4條帶(161、30、12、7 bp)，本基因型的判斷主要通過讀取99及161 bp兩個條帶來完成。

2．2冠心病組及對照組兩組人群待測位點T/C多態性比較分析此位點多態性分布在如上兩組人群中的分布頻率有顯著性差異(P<0.05)，詳見表2。

表2　冠心病組與對照組β3-AR基因第一外顯子190位點T/C頻率分布〔n(%)〕

冠心病組與健康中老年組對比顯示組間基因型分布存在明顯差異P<0.05

2．3SYNTAX評分各組人群待測位點T/C多態性比較分析冠心病3個亞組間此位點多態性分布無顯著性差異(P>0.05)，詳見表3。

表3　SYNTAX評分各組β3-AR基因第一外顯子190位點T/C頻率分布〔n(%)〕

如上三組間待測位點多態性分布頻率差異無顯著性P>0.05

3討論

冠心病近年來發病呈現明顯上長趨勢。2008年世界衛生組織統計數字顯示心血管病患者約占全年總死亡人數的1/4。目前以細菌培養加藥敏為指導的抗生素正規使用及以多維超聲在產前檢查中應用的日益廣泛，就病因將心血管疾病分類的組成比例也隨之明顯改變，也就是原來在心血管病組成中占主要比例的風濕性心臟病和先天性心臟病的比例明顯減低，而冠心病隨著全社會的人口老齡化在心血管病中的比率大為提高。在我國有統計數字顯示冠心病在男性發病率比過去增加26.10%，在女性為19.00%。對中老年人群而言，冠心病是一種常見而后果嚴重的疾病，從基因角度將其病因進一步闡明一直是眾多心血管科醫務工作者的渴望。許多醫務工作者堅定的認為冠心病是一種與多基因相關的疾病，如果這一疾病的基因水平發病相關因素得以一一闡明，那么對這一疾病的防、診、治能力將隨之有極大的提高。

β3-AR是眾多跨膜受體中的一種，是G蛋白偶聯受體，這種受體在人類的棕色及白色脂肪中均有分布。除此之外，心臟、消化道、骨骼肌等部位也有這種受體分布，但含量相對脂肪組織較少。β3-AR具有促進白色脂肪分解及棕色脂肪產熱的作用，是人體基礎代謝率和脂肪代謝的重要調節因子。已有臨床研究證明冠心病患者的血膽固醇、低密度脂蛋及甘油三酯水平均明顯高于無冠心病者。血脂異常者更易發生動脈粥樣硬化，且血脂異常的嚴重程度與血管病變的程度及彌漫程度正向相關[5]。有血脂異常的冠心病患者經正規的他汀類藥物治療，其冠心病程度的進展會得到一定程度的控制[6]。鑒于如上分析，β3-AR基因就成了研究冠心病發病相關因素的重要候選基因之一，針對這一基因各多態性位點的研究將會對冠心病基因水平的發病相關因素的闡明有所幫助。

人β3-AR的一級結構由402個氨基酸組成，分子量為42281，其四級結構中含20余處疏水區，最終可以構成細胞內外各4處功能區。該基因由2個外顯子和1個內含子組成，位于8號染色體。β3-AR基因編碼區在第一外顯子第190位點存在T/C多態性，這個位點核苷酸由胸腺嘧啶核苷酸到胞嘧啶核苷酸的轉變會引發β3-AR一級結構第64位氨基酸密碼子的改變，即由色氨酸密碼子(TGG)改變為精氨酸密碼子(CGG)，這一突變會引起β3-AR的翻譯結果，改變蛋白質一級結構。而這個因基因突變而變化的氨基酸是位于β3-AR的第1個細胞內環上，第一個細胞內環是β3-AR 完成偶聯和發揮效應器功能至關重要的部位[7]。這一氨基酸改變可導致β3-AR活性下降，也就是說這一位點變異可以阻礙與脂代謝相關的細胞信號傳導，從而降低棕色脂肪和白色脂肪的脂解和產熱效應，并降低基礎代謝率，從而導致血脂異常而成為冠心病的高危因素。

要著手研究某候選基因與冠心病嚴重程度的相關性就必須對冠心病的輕重分度有一個相對客觀的方法。眾所周知冠心病臨床表現是多種多樣的，癥狀輕重不一，但冠狀動脈粥樣硬化的病理表現是絕大多數患者共同具有的。冠狀動脈造影一直是冠心病診斷的金指標，即使如此，冠脈病變的部位及程度使本病的分度相當復雜，而SYNTAX研究總結出了一套評分方案[8]，可以用于評價冠狀動脈病變的程度，且這一評分方式綜合考慮了如上所述的冠脈造影結果的各種復雜因素，是較為客觀的分度方式，此評分越高說明冠脈病變程度越重，同時也意味著預后可能越差[9]。鑒于此，本實驗依據此評分結果將冠心病組患者分度，所得結果是有一定可信度的。

事實上冠心病發生不僅與遺傳因素有一定的相關性，還與許多外界因素比如多種環境因素有關，β3-AR基因如上位點與冠心病的發病具有一定程度相關性而與SYNTAX評分所示的冠心病輕重程度無關，這其中有兩種可能性：其一，冠心病作為一種具有一定程度遺傳傾向的疾病，其發病也必然是與多種基因變異相關的，β3-AR基因第一外顯子的第190位點的多態性可能是與冠心病發病相關而與其發病程度不具相關性的位點；其二，在冠心病發生及不斷加重的進程中，可能有些許基因水平的因素與之相關，但諸多后天因素如環境因素、生活習慣等也一定是冠心病發生、進展的重要因素[10]，而這些因素在冠心病加重的進程中可能所起的作用更大。

參考文獻：

[1] Vrydag W,Alewijnse AE,Michel MC.Do gene polymorphisms alone or in combination affect the function of human β3-adrenoceptors [J]．Br J Pharmacol,2009,156(1):127.

[2]Scherff F,Vassalli G,Sürder D,et al.The SYNTAX score predicts early mortality risk in the elderly with acute coronary syndrome having primary PCI [J]．J Invasive Cardiol,2011,23(12):505.

[3]王龍武，石柯，彭愛紅.一種快速微量外周血基因組DNA的提取方法[J].中國現代醫學雜志，2004，360(8)：10.

[4]曹潔,李碩,陳寶元,等. 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者β3腎上腺素受體基因Trp64Arg突變的研究[J].中華結核和呼吸雜志,2004，27(6)：413.

[5]孫勝，李明秀，陳學忠．易損斑塊穩定性評價與研究進展[J]．嶺南心血管病雜志,2014，20(1)：125.

[6]陳瑞雪，張麗華，李小威．鄭州市區冠心病患者他汀類藥物應用現狀分析 [J]．中國心血管雜志,2014，19(1)：42.

[7]Zhu LY，Hu LY，Li XL．Relationship between Trp64Arg mutation in the β3-adrenergic receptor gene and metabolic syndrome：a seven-year follow-up study[J]．Chin Med J(Engl)，2010，123(17)：2375.

[8]Lee TH，Hillis LD，Nabel EC，et al．Stenting-clinical implications of the SYNTAX trial[J]．Engl J Med，2009，1(2):219.

[9]Garg S,Sarno G,Garcia-Garcia HM,et al.A new tool for the risk stratification of patient with complex coronary artery disease:the clinical SYNTAX score[J]．Circ Cardiovasc Interv,2010,3(4):317.

[10]楊淑珍，孫宇．血清胱抑素C和尿酸水平對冠心病病變程度的預測價值[J]．中國實驗診斷學,2014，18(2)：265.

(收稿日期：2014-07-26)

文章編號：1007-4287(2015)07-1157-03