FXR在肝細胞癌組織和癌旁正常組織中的差異表達

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FXR在肝細胞癌組織和癌旁正常組織中的差異表達

孟祥寬1,劉念1，馮虎1,陳玉丙1,王欣2*

(吉林大學第二醫院 1.放療科;2.檢驗科，吉林 長春130041)

肝細胞癌(HCC)占原發性肝癌的90%。每年大約有67萬新發病例，在全世界惡性腫瘤中，發病率占第五位，而死亡率則排第三，嚴重危害人民的健康[1]。HCC的發生和發展是一個涉及多因素、多基因和多步驟的復雜過程[2]，其具體機制仍在不斷探索之中。近年來，越來越多的證據顯示長期高水平膽汁的刺激、脂肪肝等機體代謝失調與HCC的發生有關[3，4]。法尼酯X受體(FXR)是核受體超家族的一員，人的FXR基因定位于12號染色體(12q23.1)，主要在肝、小腸、腎及腎上腺組織中表達，調節膽汁酸代謝、膽固醇代謝、脂代謝，有維持機體代謝穩態的作用[5]。可見FXR的正常表達對抑制HCC的發生有很大意義。在動物實驗中，Yang F[6]首次發現FXR基因敲除的小鼠將會自發形成HCC，隨后Kim[7]的研究也證實了這一結論。但是，人HCC的形成與FXR表達的關系尚不清楚。本研究擬通過分析50例臨床HCC患者癌組織及癌旁正常組織FXR表達的差異，探討人HCC的形成與FXR表達的變化關系。為HCC的臨床治療實踐制定新策略及藥開發新靶點提供理論基礎。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1病例來源選取2012年08月至2013年12月吉林大學第二醫院肝膽外科住院接受肝切除術治療的50例HCC患者的肝癌組織及癌旁正常組織。患者病歷資料完整，均于術后經吉大二院病理科病理檢查證實為肝細胞癌，所有病例術前均未行放化療及免疫治療。組織標本于術后立即切取，取癌旁組織(距癌組織5 cm以上)作為對照組。甲醛固定，石蠟包埋。

1.1.2試劑鼠抗人FXR單克隆抗體(Abbiotec，購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司)免疫組化染色試劑盒(即用型免疫組化 kit-9710，購自福州邁新生物技術開發有限公司)。

1.2　方法

1.2.1免疫組織化學法對癌組織和癌周正常組織FXR進行免疫組化染色。所有標本均經過甲醛固定，石蠟包埋，4um連續切片，常規HE染色，鏡檢。將載玻片用二甲苯脫石蠟，隨后用乙醇和PBS洗滌。組織切片用EDTA緩沖液高壓修復10 min，修復后的切片在緩沖液中冷卻后，滴加過氧化物酶阻斷溶液；用50-100 ml血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜；滴加生物素標記的第二抗體，室溫10 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫10 min；DAB顯色，蘇木素復染2 min，鹽酸酒精分化，氨水返藍，過酒精(80% 2 min，90% 2 min，95% 2 min，100% 5 min，100% 5 min)，過二甲苯 3 min，過二甲苯 3 min；樹脂封片，鏡檢。

1.2.2結果判定 觀察肝癌和癌旁組織中陽性細胞所占比例和細胞核FXR陽性染色的強弱，并使用IMAGE PRO軟件處理圖像得到灰度值。

1.3統計學處理Excel表格收集數據，除6例患者癌旁組織資料缺失外，對其余44例患者的肝癌組織與癌旁正常組織FXR表達差值進行正態分布檢驗，如符合正態分布，采用配對t檢驗分析肝癌和癌旁組織中FXR表達的差異，如不符合正態分布，校正后進行配對T檢驗，全部統計過程通過SPSS21.0實現。

2結果

2.1臨床特征分析收集的50例HCC患者的94個臨床組織標本(肝癌組織50例，癌旁組織44例)的臨床特征詳細列于表1。可見肝癌高發年齡段為40-60歲，男性明顯多于女性，可能與男性飲酒、肥胖有關。

2.2FXR在肝癌和癌旁組織中的表達所有選定的肝癌患者均經過HE染色組織病理學確診為肝細胞癌(見圖1 A，A′，B，B′)。通過免疫組織化學染色法檢測，我們發現FXR在肝細胞癌組織中核FXR陽性染色較淺，呈黃色，且陽性細胞所占比例小(見圖1 E，E′，F，F′)。而癌旁正常組織中核FXR陽性染色較深，呈黃褐色；且陽性細胞所占比例大(見圖1C，C′，D，D′)。

表1　94例組織樣本的臨床特征

2.3免疫組化圖像的相對灰度值分析使用IMAGE PRO軟件對肝細胞癌和癌旁組織的免疫組化結果分析得到相對灰度值。將癌旁組織資料缺失的6例患者去除，將剩余的44例患者的肝癌組織與癌旁組織組成配對資料。FXR表達量的差值行正態分布分析，均值=0.09，標準偏差=0.034，中值=0.08，眾數=0.07，采用Kolmogorov-Smirnov及Shapiro-wilk法檢驗，P值分別為0.094和0.397，符合正態分布(見圖2，3)。用配對t檢驗分析肝癌組織與癌旁組織FXR表達量的差異，結果顯示FXR在肝癌組織中的表達與癌旁組織相比顯著降低(t=14.765，P<0.00001)，見表2。

圖1　兩例HCC患者癌組織和癌旁組織FXR的表達差異

圖2　肝癌組織與癌旁組織FXR表達量差值的

圖3　肝癌組織與癌旁組織FXR表達量比較

3討論

近期研究[6,7]報道了FXR基因敲除的小鼠將會自發形成HCC，而人HCC的發生與FXR表達情況的關系目前還不太清楚。本研究選取了來自50例HCC患者的94個標本(包括肝癌組織50例及癌周正常組織44例)，通過免疫組化染色分析了FXR在癌組織及癌旁正常組織的表達情況，檢測結果提示肝癌組織與癌旁正常組織相比陽性細胞所占比例小，且核FXR陽性染色較淺。使用IMAGE PRO圖象分析儀得到的灰度值，通過配對t檢驗顯示FXR在肝癌組織中的表達與癌旁組織比較顯著降低(P<0)。不獨有偶， Lax S[8]等研究發現人結腸癌組織與癌周組織比較 FXR 表達下降，其下降程度與腫瘤的惡性程度呈正相關。這可能與FXR下調造成的長期高水平膽汁酸的潛在致癌性有關。

表2　肝癌組織與癌旁組織FXR表達量配對t檢驗的結果

研究表明[9]FXR被內源性配體膽汁酸或人工合成配體激活后,與視黃醛X受體(retinoidX receptor,RXR)結合形成異二聚體,通過與靶基因中稱為FXR反應元件的特定核苷酸序列結合而調節靶基因的轉錄。通過抑制膽汁酸合成途徑中的膽固醇7-α羥化酶而控制膽固醇轉變為膽汁酸，促進肝膽汁酸的排泄并減少腸肝循環中膽汁酸的回吸收，從而保護膽汁的過度負荷對肝臟造成的損害。Zhang Y[10]發現FXR還可以通過小異二聚體伴侶(SHP)促進細胞凋亡和抑制細胞增殖，活化的FXR可能不僅對非腫瘤細胞的增殖重要，還可能阻斷腫瘤的生長。

FXR表達的減少可能出現在正常肝細胞逐步惡變到肝癌的過程中，由于我們沒有系統地分析肝細胞變性、肝炎、肝硬化到肝癌的整個過程，我們不能確定FXR表達缺失到底發生在癌變的哪一個環節。其中的變化機制值得我們進一步的研究。

FXR參與體內代謝平衡、細胞的增殖和凋亡，甚至在HCC發展中的具有潛在作用，這一結論可能會打開HCC預防和治療的新途徑。由于正常肝組織逐漸惡變到肝癌與FXR表達降低甚至喪失有關，通過刺激FXR的信號通路來調節細胞增殖和分化可能成為一種新的治療癌癥的靶點或策略。

參考文獻：

[1]Wang Z,Zhang G,Wu J,et al.Adjuvant therapy for hepatocellular carcinoma:current situation and prospect[J].Drug Discov Ther，2013，7(4):137.

[2]Wapinski O,Chang HY.Long noncoding RNAs and human disease[J].Trends Cell Biol，2011，21(6):354.

[3]Tanaka K,Tsuji I,Tamakoshi A,et al.Obesity and liver cancer risk:an evaluation based on a systematic review of epidemiologic evidence among the Japanese population[J].Jpn J Clin Oncol,2012，42(3):212.

[4]Tsuei J,Chau T,Mills D,Wan YJ.Bile acid dysregulation,gut dysbiosis,and gastrointestinal cancer[J].Exp Biol Med (Maywood)，2014，239(11):1489.

[5]Wang YD,Chen WD,Moore DD,et al.FXR:a metabolic regulator and cell protector[J].Cell Res，2008，18:1087.

[6]Yang F,Huang X,Yi T,et al.Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor[J].Cancer Res，2007，67(3):863．

[7]Kim I,Morimura K,Shah Y,et al.Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice[J].Carcinogenesis，2007，28(5):940．

[8]Lax S,Schauer G,Prein K,et al.Expression of the nuclear bile acid receptor/farnesoid X receptor is reduced in human colon carcinoma compared to nonneoplastic mucosa independent from site and may be associated with adverse prognosis[J].International journal of cancer. Int J Cancer，2012，130(10):2232.

[9]Zhang Y,Kast-Woelbern HR,Edwards PA.Natural structural variants of the nuclear receptor farnesoid X receptor affect transcriptional activation[J].J Biol Chem，2003，278(1):104.

[10]Zhang Y,Soto J,Park K,et al.Nuclear receptor SHP,a death receptor that targets mitochondria,induces apoptosis and inhibits tumor growth[J].Mol Cell Biol，2010，30:1341.

(收稿日期：2014-09-18)

文章編號：1007-4287(2015)07-1169-03

*通訊作者

基金項目：本論文研究受吉林省科技廳項目資助(項目編號為：201215072)