高產漆酶真菌菌株的篩選及酶學性質研究

馬現成，任國莉，劉宇，劉淑靜，王忠超，張躍華*

(1.佳木斯大學理學院，黑龍江佳木斯154007；2.黑龍江省湯原波巴布生物科技有限公司)

高產漆酶真菌菌株的篩選及酶學性質研究

馬現成1，任國莉1，劉宇1，劉淑靜1，王忠超2，張躍華1*

(1.佳木斯大學理學院，黑龍江佳木斯154007；2.黑龍江省湯原波巴布生物科技有限公司)

從6株野生真菌和5株食用真菌中篩選出高產漆酶菌株，并對篩選出的野生菌株漆酶酶學性質進行初步探究。使用G-PDA確定菌株的產漆酶能力，然后通過液體發酵對產生的粗酶液進行酶活力測定，確定高產漆酶菌株，最后分別在不同pH和溫度下進行酶學性質探究。 初步篩選結果：第7天時，05號菌絲直徑最大89.1mm，08號顯色圈直徑最大76.8mm，04號的顯色圈顏色最深，09號顯色反應最不明顯。對于漆酶活力：04號活力最高262.7U/mL，其次是08號和05號分別為255.3 U/mL、203.9 U/mL。01和06號酶活力達到最大所需時間最短。 酶學性質方面，08號的最適pH是3.2、最適溫度是40℃；在不同pH、溫度下分別保溫2h， pH=4.0酶活力殘余率為94.20%；溫度在20～40℃內，酶活力殘余率在99.00%以上。結果表明，0.04%G- PDA最適作為產漆酶真菌的初篩培養基；高產漆酶能力的菌株有 04、05和08號菌株，且08號菌株漆酶的最適應用條件是pH=4.0、溫度為40℃。

真菌；漆酶；篩選；酶學性質

漆酶(Laeease)是一種含銅多酚氧化酶，主要存在于植物和微生物體內，能夠催化氧化多種芳香族和非芳香族化合物，同時氧氣被還原為水[1]。日本學者Yoshida在1883年于漆樹汁液中首次發現漆酶[2]；1895年，Bertrand 第一次將其以生漆固化的活性物質分離出來，并首次將其命名為漆酶[1]。

19世紀末，研究人員發現一些高等真菌也能分泌漆酶[4]。經過一個多世紀的研究發現漆酶廣泛存在于擔子菌、多孔菌及子囊菌等菌中，其中最主要的漆酶生產者是擔子菌的白腐真菌[5]。由于漆酶作用底物的廣泛性和非底物特異性，因而漆酶可以廣泛地運用于造紙業、酒類制造、食用菌生產和飲料制造等行業。隨著漆酶的應用研究取得更大的突破性成果和顯著性成就，漆酶對染料等污染物降解及環境生物修復等更多領域也有著重要的應用價值。因而，真菌漆酶的生產也越來越受到人們的關注，大量的研究工作圍繞如何提高真菌漆酶的產量而展開。本文主要研究的是高產漆酶菌株篩選及漆酶酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料

本次篩選實驗共選用了11種真菌菌株，其中5株為佳木斯大學環境微生物實驗室保存的食用菌，分別是香菇(Lentinusedodes)01號菌株、金針菇(Flammulinavelutipes)02號菌株、雞腿菇(Coprinuscomatus)03號菌株、杏鮑菇(Pleurotuseryngii)04號菌株、側耳(Pleurotusostreatus)05號菌株；另外6株為伊春市仙翁山國家森林公園采集分離，分別是毛木耳(Auriculariapolytricha)06號菌株、香栓菇(Trametessuaveloens)07號菌、樺褶孔菌(Lenzitesbetulina)08號菌株、紅乳菇(Lactariusacris)09號菌株、淡黃木層孔菌(Phellsnusgilvus)10號菌、楊樹菇(Agrocybeaegerita)11號菌株。

1.2 培養基

PDA培養基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂 16～20，pH 自然。

愈創木酚PDA選擇培養基(G-PDA)：PDA培養基中添加0.04%的愈創木酚[6]。

液體發酵培養基(g/L)：在液體PDA的基礎上，KH2PO42，MgSO41.5，VB1微量[7]。

1.3 操作方法

1.3.1 愈創木酚濃度對顯色圈的影響。取28℃恒溫培養箱中活化培養7天直徑為8.5mm的08號菌株菌片，分別轉接到添加愈創木酚濃度為0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的PDA平板培養基上。置于30℃恒溫培養箱中倒置培養，每個梯度5個重復。

1.3.2 G-PDA培養基初篩。取活化培養7天直徑為8.5mm的菌片，轉接到G-PDA平板培養基中心位置，置于30℃恒溫培養箱中倒置培養。每隔24h觀察記錄一次顯色圈變化情況，每個菌株5個重復。

1.3.3 液體發酵復篩。在200mL錐形瓶中加入100mL的液體發酵培養基，接入活化培養7天直徑為8.5mm的菌片3個。在28℃、130r/min條件下搖瓶培養，從第5天開始測定酶活力。

1.3.4 粗酶液提取及活性測定。發酵液在4℃、5000r/min條件下離心15min，取上清液即為粗酶液[8]。取粗酶液、0.5mmol/L的ABTS(2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)及pH為4.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液各1mL，分別在30℃保溫5mins，混合反應30s后，在波長420nm的紫外-可見分光光度計中測定吸光度變化。定義每分鐘轉化1μmol的底物所需的酶量為一個酶活力單位，用U/mL表示[9]。

1.3.5 酶的最適pH及pH穩定性[10]。在不同pH的緩沖液中按標準方法測定酶活，以酶活力最高時的pH為最適反應pH。將酶液在30℃不同pH的緩沖液中保存2h，按標準方法測定殘余酶活，以未經保存處理的酶液酶活力為100%。

1.3.6 酶的最適溫度及溫度穩定性[11]。在不同溫度條件下按標準方法測定酶活，以酶活力最高時的溫度為最適反應溫度。酶液在不同溫度下保溫2h，快速冷卻至室溫，按標準方法測定殘余酶活，以未經保溫處理的酶液酶活力為100%。

2 結果分析

2.1 不同濃度愈創木酚對顯色圈影響結果

08號菌株在不同濃度G-PDA平板培養基上的生長情況及顯色圈(氧化圈)顏色深度(見表1，見圖1)。實驗結果表明，在第7天時，0.02%的G-PDA上的08號菌絲長滿整個平板；當愈創木酚的濃度大于0.04%時，雖然顯色圈的顏色比較深，但是對菌株的生長會產生比較明顯的抑制作用；而當愈創木酚濃度小于0.04%時，顯色圈的顏色會比較淺且出現顯色圈所需的時間較長。菌株在0.04%的G-PDA上培養24h就明顯出現顯色圈，且沒有明顯抑制作用，故在真菌菌株具有產漆酶能力的初步確定時，選用0.04%的G-PDA最為合適。

表1 不同濃度愈創木酚對08號的影響

注：+淺；++深；+++很深。

圖1 不同濃度G-PDA上菌株的長勢情況

2.2 初篩結果

各菌株在G-PDA上的顯色反應結果表明(見表2)，11種真菌在G-PDA上均有一定程度的顯色反應。05號菌株菌絲生長速度最快，在第7天直徑達到89.1mm(平板直徑90mm)；而第7天時，08號菌株的顯色圈最大，達到76.8mm；04號菌株的顯色圈顏色最深。直到第5天以后，09號菌株才出現顏色很淺的顯色圈，菌絲的生長速度也明顯落后于其他菌株，其產漆酶能力可以忽略，而其他10種菌株均具有一定產漆酶能力。

表2 菌株在G-PDA上的顯色反應結果

注：-無；+淺；++深；+++很深。

2.3 復篩結果

對菌種進行液體發酵實驗結果表明(圖2，圖3)：食用菌的酶活力普遍比較高，而野生菌的酶活力普遍較低。除部分菌株在第7天酶活力達到最大值，其他菌株酶活力達到最大值的時間主要集中在10～13天。食用菌中酶活力最高的是04號菌株，在第11天達到最高262U/mL；其次為05號菌株，在第13天達到203 U/mL。01號菌株酶活力最大值最先出現。野生菌中酶活力最高的是08號菌株，在第11天達到最大255 U/mL，其他的菌株的酶活力均集中100 U/mL以下，酶活力最先出現最大值的是06號菌株。

圖2 食用菌液體發酵產漆酶酶活情況

圖3 野生菌液體發酵產漆酶酶活情況

結合顯色反應發現，酶活力較高的菌株不僅顯色反應出現較早，而且顯色強烈或顯色圈直徑較大。最終確定04、05和08號3種菌株為高產的漆酶菌株，而01和06號菌株的酶活力出現最大值所需的時間最短，在實際的生產應用中也有著比較重要的意義。

2.4 酶的最適pH及pH穩定性

不同pH對08號菌株酶活力的影響及pH穩定性的實驗結果表明(圖4)，pH=3.2時08號菌株的漆酶活性最高。隨著pH值得增加到4.0以后，酶活力開始大幅度的下降。30℃條件下，酶液在不同pH的緩沖液中保存2h，殘余的酶活力均在40%以上，在pH4.0～4.8范圍內，酶活力殘余率超過90%。pH=4.0時，酶活力殘余率最高94.20%，而pH=3.2時，酶活力殘余率僅有68.50%。因此08號菌株的漆酶應用最適pH為4.0。

圖4 pH對08號菌株漆酶活力影響及pH穩定性

2.5 酶的最適溫度及溫度穩定性

不同溫度對08號菌株酶活力的影響及溫度穩定性的實驗結果表明(圖5)，08號菌株酶活力的最適溫度為40℃。隨著溫度超過40℃，酶活力逐漸下降，且當溫度達到70℃時酶活力殘余率僅有9.17%。在20～40℃范圍內，酶液保存2h對酶活力影響很小，酶活力殘余率在99.00%以上。故08號菌株漆酶的最適應用溫度為40℃。

圖5 溫度對08號菌株的漆酶酶活影響及溫度穩定性

3 討論與展望

在產漆酶菌株的初篩中，以愈創木酚為底物進行顯色反應能夠確定菌株是否具有產漆酶能力，但不能判斷產漆酶能力大小。故需要通過液體搖瓶發酵，提取粗酶液進行精確的酶活力檢測。通過部分野生菌和食用菌的產漆酶能力比較發現，野生菌的漆酶生產能力相對較弱。因為食用菌通過研究人員的馴化、選育或基因改造，能夠很好地適應于含有大量木質素和纖維素的木屑等做的菌袋并且生長速度很快，所以具有較好的產漆酶能力。在實際生產中應用漆酶降解作用時，不僅需要了解漆酶的最適pH和溫度，更需要了解漆酶活性在不同pH和溫度下的穩定情況。

在環境問題日益惡化的今天，將漆酶應用于污染物治理有著重要的應用價值和實際意義。因此在產漆酶菌株的篩選中，不僅需要具有高產能力的菌株，更需要能夠在最短時間中達到最大酶活力的菌株。所以對于篩選出的高產菌株還要進一步的探索，以便縮短出現最大酶活所需的時間和提高漆酶活力。如：(1)在液體發酵培養基的制備中，選擇合適的碳源和氮源；(2)在發酵培養基中加入Cu2+等有促進產酶作用的誘導因子；(3)對漆酶活性最大值出現較早的菌株和漆酶活力較大的菌株利用細胞融合技術處理；(4)利用基因工程方法，對產漆酶菌株進行基因改造。

[1]傅愷. 一株新型白腐菌產漆酶規律及其酶學性質的研究[D].廣州：華南理工大學, 2010.

[2]Manolopoulos V G, Samet M M, Dr. P I L. Regulation of the adenylyl cyclase signaling system in various types of cultured endothelial cells [J]. Journal of Cellular Biochemistry, 1995, 57(4): 590-598.

[3]Mayer A.M., Staples R.C. Laccase: new functions for an old enzyme[J]. Phytochemistry, 2002, 60(6): 551-565.

[4]Cordi L, Minussi R.C, Freire R.S, et al. Fungal laccase: copper induction,semi-purification, immobilization, phenolic effluent treatment and electro chemical measurement[J]. African Journal of Biotechnology. 2007, 6(10).

[5]周蕊. 滑菇(pholiota namek)漆酶的誘導、純化、cDNA克隆及表達[D]. 南京：南京林業大學, 2007.

[6]王宜磊, 朱陶, 鄧振旭，等. 愈創木酚法快速篩選漆酶產生菌[J].生物技術, 2007, 17(2):40-42.

[7]郭梅, 蒲軍, 梁鵬,等. 白腐菌Trametes versicolor產漆酶發酵條件的優化[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(6):9-12.

[8]鄒建炫. 白腐真菌產漆酶對染料廢水降解的研究[D].南京：南京理工大學, 2004.

[9]Bourbonnais R&Paice M G. Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation [J]. FEBS Lett,1990, 267: 99-102.

[10]肖楚, 劉佳, 許修宏. 黑木耳漆酶酶學性質的研究[J].中國農學通報, 2011, 27(25):158-161.

[11]肖楚. 黑木耳漆酶高產菌株篩選及發酵條件、酶學性質的研究[D].哈爾濱：東北農業大學,2012.

Screening of High-yield Laccase Fungal Strains and Enzymatic Characteristics Study

Ma Xiancheng1, Ren Guoli1, Liu Yu1, Liu Shujing1, Wang Zhongchao2, Zhang Yuehua1*

(1.College of Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007;2.Tangyuan Bo Ba-bu Biotechnology Co. Ltd. Heilongjiang)

Object: Laccase High-yielding strains are screened from 6 wild fungi and 5 edible fungi. And a preliminary study of laccase enzymatic characteristics of screened wild yield laccase strains. Method: The use of G-PDA identified 11 kinds of fungal laccase production capacity. Then, the crude enzyme solution generated by liquid fermentation activity,which was measured, and got High-yielding strains of laccase. At last,Laccase put separately at different pH and temperature measurement of enzyme activity. Results: Preliminary screening results: In the first 7 days, No.05 mycelium largest diameter is 89.1mm, No.08 color-circle diameter is 76.8mm, No.04 color-circle color is the deepest, The color reaction No.09 is the most obvious. For laccase activity: No.04 highest enzyme activity is 262.7U/mL. Secondly, No.08 , No.05 are 255.3U/mL, 203.9U/mL respectively. Enzyme activity reached maximum shortest is No.01 and No.06. In terms of the enzymatic properties ,the optimum pH is 3.2, the optimum temperature is 40℃ of No.08 strain. At pH=4.0, the residual of enzyme activity was 94.20%; In the 20～40 ℃, the lowest rate of residual enzyme activity was 99.00%. Conclusion: 0.04% G-PDA as the optimal screening fungal laccase production medium. Strain has the ability to determine the High - yielding of laccase for No.04, No.05 and No.08 strains. And 08 strains of Laccase optimal utilization conditions is pH=4.0, and temperature is 40℃.

Fungi; Laccase; Screening;Enzymatic characteristics

2015-04-30

佳木斯大學大學生科技創新項目(xslz2014-006)；佳木斯大學科學技術校級面上項目(L2013-076)

馬現成(1993-)男，本科在讀，環境科學專業，E-mail: 15945886494@163.com；*

TQ920.6

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.04.003