體外培養SD大鼠神經干細胞多向分化的實驗研究*

黃學平 鄭捍東 葉維霞 吳文友

(瀘州市人民醫院 1.神經外科, 2.消化內科， 四川 瀘州 646000)

體外培養SD大鼠神經干細胞多向分化的實驗研究*

黃學平1鄭捍東1葉維霞2吳文友1

(瀘州市人民醫院 1.神經外科, 2.消化內科， 四川 瀘州 646000)

目的 分離培養SD大鼠神經干細胞( NSCs)，誘導分化，為神經干細胞的分化研究提供基礎實驗依據。方法 分離新生24小時內SD大鼠端腦及中腦，采用無血清培養技術進行NSCs體外擴增培養及傳代。對NSCs及其分化后的細胞進行nestin、GFAP、NF 200免疫細胞化學染色。結果 分離培養的細胞增殖活性好，6～7天后生長成由上百個細胞組成的大克隆球，nestin呈陽性表達。經誘導分化后，克隆球間存在網絡狀結構，GFAP和NF 200呈陽性表達。結論 實驗中分離培養的神經干細胞具有自我更新和增殖能力，并具有向星形膠質細胞和神經元等方向分化的多向分化潛能。

SD大鼠； 神經干細胞； 免疫細胞化學； 多向分化

神經干細胞是存在于神經系統內的一群具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞，可以分化形成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞[1，2]。近年來，神經干細胞的研究成為神經科學領域的熱點之一。神經干細胞移植被認為是治療神經系統損傷后修復和其他神經系統疾病最具前景的方案之一[3]。本研究采用新生24小時內清潔級SD大鼠作為供體，分離培養神經干細胞，通過觀察、檢測神經干細胞向神經元、星形膠質細胞分化的生物學特性，為神經干細胞的分化研究提供更多實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24小時內清潔2級SD大鼠，購于南方醫科大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑 DMEM/F12培養基，D-Hank’s液(Hyclone)，B27神經細胞生長添加劑(Gibco)，bFGF、EGF(Peproteeh)，多聚賴氨酸(Sigma)，胎牛血清購自杭州四季青生物有限公司。nestin抗體購自Chemicon公司，NF 200和GFAP抗體購自武漢博士德生物技術有限公司。臺盼藍、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒由北京中杉生物技術有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 NSCs的原代分離培養 NSCs的分離：取新生24小時內清潔級SD大鼠4只，用75%乙醇消毒頭部后，斷頭處死，在超凈臺內以眼科剪逐層剪開頭皮及顱骨后，無菌條件下迅速取出端腦及中腦放入預冷的D-Hank’s 液中，去除腦膜及血管后剪碎，加入0.125%胰酶、0.02% EDTA液4 ml，37℃消化20～30 min后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基4 ml終止消化，輕柔吹打至混懸液后，用400目篩網過濾，收集濾液，1000 rpm離心5 min，棄去上清，用D-Hank's重復清洗3遍后，加入完全培養基(含2% B27，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF的DMEM/F12培養基)重懸細胞懸液，臺盼藍染色計數后，調整細胞密度為1×106/ml接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。接種后的細胞每2～3 d半量換液，培養6～7 d傳代1次。逐漸去除碎片及其他細胞，分離出NSCs。

1.3.2 NSCs的傳代培養 在原代培養第7天，無菌條件下進行傳代培養。輕輕搖動培養瓶，用吸管將沉在瓶底而沒有貼壁的神經球收集入離心管，棄去貼壁的細胞，1500 rpm離心5min，吸去上清液后，加入NSCs完全培養基，輕柔吹打使神經球盡可能分離為單細胞懸液，計數后仍以1×106/ml接種于培養瓶中常規培養。此后每2～3 d半量換液，培養6～7 d傳代1次。

1.3.3 NSCs的免疫化學鑒定 取生長良好的第3代NSCs克隆球，1×105/ml接種至預先放置多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片的24孔板內，繼續培養8小時，使大部分克隆球貼壁，將蓋玻片取出自然晾干。PBS清洗2次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定30 min后， PBS清洗干凈后以3% H2O2去離子水孵育10 min，清洗3次，再以山羊血清封閉液37℃封閉10 min。滴加一抗nestin(1∶100)，37℃孵育2小時，PBS清洗3次，每次5 min，滴加二抗B液37℃孵育20 min，PBS清洗3次，再滴加C液37℃孵育15 min，具體步驟參照SP試劑盒說明書。PBS清洗3次后DAB顯色，蘇木素復染，封片。對照染色以PBS代替一抗，余相同。

1.3.4 NSCs的誘導多向分化 取含生長良好的第3代NSCs克隆球的細胞懸液，1500 rpm離心5 min，棄去上清，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12 (1∶1)培養液輕柔吹打為單細胞懸液后，接種于多聚賴氨酸包被的無菌蓋玻片的24孔板內，隨時觀察NSCs分化狀態，繼續培養7天后，進行GFAP和NF 200的免疫細胞化學染色，方法步驟同nestin。

2 結果

2.1 NSCs形態學觀察及免疫細胞化學鑒定 倒置顯微鏡下動態觀察原代培養NSCs，細胞懸液接種24小時后可見大量單個大小相近的圓形細胞，細胞核大，胞質較少，折光性較高；2～3 d半定量換液后可見較多懸浮生長的形態不一的細胞球，呈桑椹狀，每個細胞球由數個到數十個細胞組成，折光性強，無突起生長；6～7 d后，生長成由上百個細胞組成的大克隆球(圖1a)。神經細胞克隆球經免疫細胞化學染色后，神經干細胞特異性表達的巢蛋白nestin呈強陽性表達，胞漿呈棕黃色(圖1b)。

圖1 NSCs克隆球形態及nestin免疫細胞化學染色

Figure 1 The morphology and nestin immunocytochemistry of neurosphere

注：a.培養6天的神經干細胞球，呈桑椹狀(×400)；b. 神經干細胞球nestin呈強陽性表達(SP,×200)

2.2 NSCs的誘導分化 將培養第3代的NSCs克隆球用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基進行誘導分化，12小時后可見到部分NSCs克隆球緊貼細胞培養瓶，許多偽足樣突起從克隆球中伸出；分化至第3 天時，可見許多單個細胞逐漸從克隆球中遷出，細胞由圓形轉變為有突起的細胞(圖2)。培養至第7天時，細胞突起明顯增多，細胞之間形成廣泛的網絡狀結構。

2.3 NSCs誘導多向分化細胞的免疫細胞化學鑒定 將NSCs培養至第7天時，細胞呈現多種形態，采用不同神經細胞特異性抗體進行免疫細胞化學鑒定。結果顯示，星形膠質細胞標記抗體GFAP在多角形胞體分化細胞的胞漿中呈陽性表達(圖3a)。此類細胞從胞體伸出許多長的突起，連成網狀。神經元標記抗體NF 200在卵圓形胞體分化細胞的胞漿中呈陽性表達(圖3b)。該類細胞發出突起相對較少，大部分細胞發出2個細胞突起。

圖2 神經干細胞球誘導分化后3天(×400)

Figure 2 Neurosphere differentiation for 3 d (×400)

3 討論

近年來，NSCs已被研究證實廣泛分布于胚胎和成年哺乳動物中樞神經系統的若干區域。胚胎腦的端腦、海馬、紋狀體、中腦、室管膜/室管膜下區、脊髓和成年腦的腦室下區、紋狀體、海馬顆粒下區等已成功分離培養出NSCs[2]。NSCs因其具有自我維持、自我更新、可遷徙性、轉分化性、低免疫原性、多向分化潛能等生理特性，使其成為基因治療的載體或供體細胞，且可在Ⅳ型膠原的誘導下分化為平滑肌細胞參與神經組織血管再生，為臨床上脊髓損傷、帕金森病、周圍神經損傷后肌肉萎縮的治療等提供了新的思路和方法[4～7]。

圖3 NSCs誘導分化細胞的GFAP和NF200免疫細胞化學染色

Figure 3 GFAP and NF200 immunocytochemistry of differentiated cells derived from NSCs

注：a. 分化細胞GFAP陽性 (SP,×400)；b. 分化細胞NF200陽性 (SP,×400)

本研究從新生24小時內清潔級SD大鼠的端腦及中腦成功地分離培養了NSCs，NSCs在含有能刺激神經干細胞增殖的生長因子B27、bFGF 和EGF無血清培養液中大量增殖，呈懸浮球形生長，并連續傳代生長，體現NSCs自我維持和自我更新的特性。巢蛋白(nestin)是中間絲蛋白家族的成員，被列為第Ⅵ類中間絲蛋白，該蛋白主要在神經系統中的神經干細胞及神經前體細胞中表達，可以作為神經干細胞和神經前體細胞以及胰島前體細胞的特異性標志物[8]。巢蛋白的表達是暫時性的，一旦前體細胞分化成終末分化細胞如神經元或膠質細胞，巢蛋白的表達便終止[9,10]。我們的實驗結果可見，經過傳代培養的神經細胞克隆球nestin呈強陽性表達，表明了經傳代培養的神經細胞克隆球保持了神經干細胞特性。當去除神經干細胞增殖的生長因子的作用，NSCs置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養3天后，NSCs發生分化，不僅表現為細胞生長方式發生改變，由懸浮生長變為貼壁生長，而且細胞形態也發生了改變，由圓形分化為卵圓形、多角形等多種形態的有突起細胞。隨著細胞的繼續分化，細胞突起明顯增多，分化細胞之間形成廣泛的網絡狀結構。成熟星形膠質細胞和神經元分別表達其特異性標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和神經元標記抗體NF 200。我們采用免疫細胞化學顯示，GFAP和NF200在分化細胞中呈陽性表達，表明神經干細胞經過誘導分化后，部分細胞分化為神經膠質細胞和神經元，體現了NSCs的多向分化潛能。

4 結論

通過從新生SD大鼠的腦組織成功分離、培養出NSCs，并且向星形膠質細胞和神經元等方向分化，體現了NSCs自我維持、自我更新和多向分化的基本特征。神經干細胞的體外培養為后續神經干細胞的分化研究提供了更多的實驗依據，對細胞移植治療中樞神經系統疾病的研究具有重要意義。

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The study on multiple differentiation of neural stem cells isolated from SD rat in vitro

HUANG Xueping1, ZHENG Handong1,YE Weixia2,etal

(1.DepartmentofNeurosurgery,LuzhouPeople'sHospital,Luzhou646000,Sichuan,China; 2.DepartmentofGastroenterology,LuzhouPeople'sHospital,Luzhou646000,Sichuan,China)

Objective To cultivate and induce differentiation of the neural stem cells(NSCs)in vitro, thus providing the experimental evidence for further related research．Methods Tissues of telencephalon and midbrain were isolated from the neonatal SD rat，then the NSCs were cultivated in serum-free culture medium．The immunocytochemistry was applied to detect the expression of nestin, GFAP and NF200 on NSCs and differentiated cells．Results The isolated cells grew well and grew into sphere clones of hundreds of cells after six or seven days, with positive expression of nestin. There were network-like structure between sphere clones, which expressed GFAP and NF200 protein by inducement. Conclusion The isolated and cultivated NSCs have the capacities of self-renew and proliferation, as well as pluripotentiality of differentiate into neurons and astrocytes.

SD rat; Neural stem cell; Immunocytochemistry; Multi-directional differentiation

瀘州市科技計劃項目(2012-S-40)

鄭捍東，主任醫師，E-mail:704421424@qq.com

R 446.7

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.06.004

2014-07-10； 編輯： 張文秀)