水濕困脾證與線粒體的關系研究*

★　林海鳴第一作者：林海鳴(975—)，男，碩士，講師。研究方向：中西醫結合基礎。E-mail：flashlhm@tom.com。　鄭敏麟通信作者：鄭敏麟。E-mail：809040@qq.com。　阮詩瑋　董衛國　謝永財　李長征　(.福建中醫藥大學中西醫結合學院　福州 350；.福建中醫藥大學附屬人民醫院　福州 350004)

*基金項目：福建省衛生系統中青年骨干人才培養計劃重點項目(2013-ZQN-ZD-26)；福建省科技廳重點項目(2000Z154)；福建省衛生廳中醫藥科研計劃項目(wzy0902)。

水濕困脾證與線粒體的關系研究*

★林海鳴1*第一作者：林海鳴(1975—)，男，碩士，講師。研究方向：中西醫結合基礎。E-mail：flashlhm@tom.com。鄭敏麟1*通信作者：鄭敏麟。E-mail：809220140@qq.com。阮詩瑋2董衛國1謝永財1李長征1(1.福建中醫藥大學中西醫結合學院福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬人民醫院福州 350004)

*基金項目：福建省衛生系統中青年骨干人才培養計劃重點項目(2013-ZQN-ZD-26)；福建省科技廳重點項目(2000Z154)；福建省衛生廳中醫藥科研計劃項目(wzy0902)。

摘要：目的：探討水濕困脾證的病理學基礎，以期對中醫脾的實質與線粒體的關系做更深入的研究。方法：利用SD大鼠行5/6腎切除術，制備水濕困脾動物病理模型，實驗分組為假手術組、培土制水方大劑量治療組、培土制水方小劑量治療組、模型組。治療組給予培土制水方干預，觀察各組Scr、BUN、MDA、SOD值，以及心和小腸超微結構的改變。結果：培土制水方大、小劑量組Scr、BUN、MDA均顯著低于模型組(P<0.05)；培土制水方大、小劑量組SOD均顯著高于模型組(P<0.05)。電鏡觀察心、小腸超微結構，模型組的病變最重，部分線粒體明顯腫脹；培土制水方大、小劑量組的病變輕，線粒體形態無明顯改變。結論：培土制水方能減少“水濕困脾”證大鼠心肌及小腸細胞線粒體的損傷，推測其具有清除和減少產生自由基、降低膜脂過氧化反應，從而減少線粒體和組織細胞受到毒素損害而起到保護作用。為進一步驗證“脾”的微觀實質是細胞器之線粒體提供實驗依據。

關鍵詞：水濕困脾；培土制水；慢性腎功能衰竭；尿毒癥毒素；線粒體

2002年筆者曾提出了“中醫藏象實質細胞生物學假說”(以下簡稱“藏象假說”)，指出中醫藏象的微觀實質是亞細胞結構，其中，中醫“脾”的實質是線粒體，并通過實驗驗證了腎小管細胞線粒體是“脾制水”的物質結構基礎[1-5]。那么，什么是“脾惡濕”、“水濕困脾”的病理學基礎呢？該病理學基礎與線粒體相關性如何？揭示“脾”藏象中醫證型的微觀病理學基礎，對進一步理解中醫藏象的實質有重要意義。

本研究通過制作5/6腎切除大鼠動物模型，使其水液代謝障礙、代謝廢物潴留而產生“水濕困脾”之證，然后觀察“水濕”的程度(以血肌酐、尿素氮水平為代謝廢物衡量指標)、與各系統器官(以心、小腸組織為代表)的實質細胞線粒體形態學變化，以及“培土制水”法方藥的干預作用的實驗結果，來闡明“脾惡濕”、“水濕困脾”和“脾制水”與線粒體的相關性，以期闡明“中醫藏象脾的實質是線粒體”這一假說中關于“水濕困脾”證的病理學本質。

1實驗材料

1.1實驗動物雄性SD大鼠32只，由中科院上海動物飼養中心提供，清潔級，體重180-220g。醫學實驗動物環境設施為福建中醫學院動物實驗中心,清潔級。

1.2實驗藥物培土制水方顆粒主要包括太子參、白術、茯苓、山楂、大黃等藥味，原藥材由福建省醫藥公司購買，福建省人民醫院制劑室進行制劑，每克顆粒含原生藥1克。

1.3主要試劑和儀器儀MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；低溫高速離心機(BECKMAN 64R,美國)；全自動生化分析儀(BECKMAN-CX5,美國)；透射電鏡(日立Hu-12A，日本)。

2實驗方法

2.1動物造模及實驗分組32只SD雄性大鼠適應性飼養5天后，隨機分為手術組24只、假手術組8只，手術組大鼠行5/6腎切除術，假手術組按上述手術程序進行，但不切除腎臟。手術組在術后1個月按隨機分組原則分成培土制水方大、小劑量治療組和模型組，每組各8只。

2.2藥物治療培土制水方大、小劑量組分別予以喂服培土制水方20g/kg·d、10g/kg·d，以蒸餾水2.5mL溶解喂服，模型組和假手術組喂服蒸餾水2.5mL/d。各組喂服2個月后，分別取材，檢測相關指標及電鏡觀察。

2.3標本取材及處理、血：內眥靜脈叢取血4mL，靜置，2000r/min離心10min，取血清于EP管中備用。心、小腸組織：在采集血標本后迅速采集，用4℃的1.5%多聚甲醛-3%戊二醛-0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液固定后再切成1×1×1 mm3的小塊，置于電鏡固定液的瓶中保存，備做電鏡檢查。

2.4觀察項目和檢測方法

2.4.1Scr、BUN、MDA、SOD檢測檢測腎功能指標Scr、BUN及氧化損傷指標MDA、抗氧化損傷指標SOD。黃嘌呤氧化酶法檢測S0D，硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法檢測MDA，尿酶法檢測BUN，速率法檢測Scr。

2.4.2電鏡觀察電鏡取材標本置于4℃的固定液(同前)前固定4h后，用1%鋨酸后固定1.5h，梯度丙酮脫水后，環氧樹脂618包埋，超薄切片機切片，經醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡(日立Hu-12A型)進行觀察。

3統計方法

4結果

4.1各組Scr、BUN、MDA、SOD比較模型組與假手術組相比，腎功能指標明顯升高，符合CRF造模的結果，且MDA明顯升高，SOD明顯降低；培土制水方大、小劑量組分別與模型組相比，腎功能指標明顯下降，顯示藥物干預后大、小劑量治療組均有治療作用，且MDA明顯降低，SOD明顯升高。見表1。

±s)

注：與模型組比較＊P<0.05,＊＊P<0.01。

4.2電鏡觀測各組心肌、小腸超微結構變化

4.2.1心肌(1)模型組：可見多數心肌細胞的肌絲肌節整齊且Z帶清晰，較少量的心肌細胞見輕度水腫且肌絲排列扭曲、稀疏，肌原纖維的間隙增大，少數心肌細胞呈局灶性溶解壞，少數肌質網見擴張，線粒體體積增大、腫脹明顯，無炎癥細胞浸潤心肌細胞間質。見圖1。(2)培土制水方治療組：和模型組比較，超微結構形態較好，絕大多數的心肌細胞肌絲肌節整齊且Z帶清晰，較少的心肌細胞出現水腫，極少數心肌細胞呈局灶性溶解壞死。肌質網及線粒體無明顯改變，無炎癥細胞浸潤心肌細胞間質。見圖2。

4.2.2小腸(1)模型組：可見小腸粘膜的上皮層比較完整，大多數小腸柱狀上皮細胞微絨毛排列較規則，少數柱狀上皮細胞微絨毛見缺失，粘膜層可見浸潤的淋巴細胞，數量較多的線粒體體積增大、腫脹明顯，及其基質內電子致密顆粒減少。見圖3。(2)培土制水方治療組：與模型組比較，小腸粘膜的上皮層完整，無潰瘍、糜爛。柱狀上皮細胞排列規則，粘膜層偶見少量浸潤的淋巴細胞。多數上皮細胞粗面內質網和線粒體形態正常，極少數線粒體見輕度腫脹、嵴減少，及其基質內電子致密顆粒減少。見圖4。

圖1　模型組：心肌膜下肌絲溶解，個別線粒體腫脹(×10000)

圖3　模型組：小腸線粒體腫脹(×7000)

5討論

5.1慢性腎功能衰竭(Chronic Renal Failure, CRF)與“水濕困脾”證腎臟的基本功能之一是對水液(包括代謝廢物、水及電解質)的代謝調節。當慢性腎臟疾病導致腎實質持續損害、健存腎單位的數目不足以維持正常的水液代謝時，就進入了CRF的失代償期，其直接后果是導致了各種代謝廢物無法通過腎臟排出體外，而在體內大量潴留。在CRF的尿毒癥期，有明顯的水、電解質和酸堿平衡紊亂，體內有200多種潴留的物質，其中許多是具有生物活性的有毒化合物(尿毒癥毒素)，通過循環系統到達全身，引起全身多系統、多臟器的形態學損害和機能障礙，但其毒素致病機理尚未完全闡明。

中醫有“脾制水”和“脾惡濕”的理論，如《素問·至真要大論》說：“諸濕腫滿，皆屬于脾。”吳崑在《醫方考》中說：“濕淫于內者，脾土虛弱不能制水而濕內生也。”《景岳全書·腫脹》指出：“蓋水為至陰,故其本在腎……水唯畏土，故其制在脾。”又云“今脾虛則土不制水而反克。”中醫理論認為，當津液無法正常運化而潴留時，就形成病理產物“水濕痰飲”；其聚于身體局部的為“痰”為“飲”，彌漫周身者為“水”為“濕”。因此，按照中醫理論，這些潴留在體液內的代謝廢物(即所謂的尿毒癥毒素)，就是“水濕”之邪，而尿毒癥毒素引起全身各系統的損害和功能障礙、代謝障礙所表現出來的身體困重無力、納少便溏等臨床癥狀，按中醫辨證屬“水濕困脾”證。

5.2“藏象假說”線粒體是中醫藏象“脾”的微觀實質[1-5]

5.2.1中醫藏象實質的細胞生物學假說2002年筆者提出了“藏象假說”[1-2]，指出藏象的本質是在細胞和亞細胞結構，中醫“五藏”的微觀實質是細胞的五個不同功能系統，對應為五個不同的亞細胞結構，即中醫之“心”-離子通道，中醫之“肝”-配體-受體-信號轉導系統，中醫之“脾”-線粒體，中醫之“肺”-細胞膜，中醫之“腎”-染色體。

5.2.2中醫藏象中“脾”的微觀實質是線粒體線粒體是細胞氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所，線粒體的三羧酸循環是三大營養物質(糖類、脂類、蛋白質)分解的共同途徑和最終通路。機體從消化系統(中醫之“胃腑”)攝入的三大營養物質(中醫之“水谷精微”)，通過線粒體的氧化磷酸化合成能源物質ATP(中醫之“氣”),為細胞乃至機體提供了能量。這一過程體現了“脾主運化”的機能中最重要的一方面，即營養物質在線粒體中的生物氧化及產生能量的過程。此外，三羧酸循環的中間產物，為細胞其他合成代謝提供小分子前體，因此，線粒體是細胞乃至整個機體生命活動的樞紐和核心。這與中醫理論認為“脾胃為后天之本,氣血生化之源”的認識是一致的。線粒體又是對體液環境高度敏感的細胞器，病變時機體內環境穩態失衡，細胞外液中PH值、滲透壓改變、缺氧及各種毒素等(水濕之邪)，都可能損害線粒體的結構及功能，這又與中醫“脾惡濕”的特性相契合。

所有代謝旺盛、對能量需求高的臟器，其組織細胞內都富含有線粒體，如肌肉的收縮、腎小管的重吸收、肝臟參與的物質代謝等均要消耗大量能量，相應的，這些臟器的組織細胞(肌細胞、腎小管細胞、肝細胞)內線粒體數量眾多，這與中醫理論中“脾主肌肉四肢”、“脾制水”、“脾主運化水谷精微”的觀點密切相關。目前已有學者[6]從線粒體生物合成中能量代謝方面探討線粒體與“脾主肌肉”相關性研究，其它方面有待更深入的實驗研究探討。

5.3“水濕困脾”證、“培土制水”法與線粒體

5.3.1“水濕困脾”證與線粒體線粒體是內毒素的作用靶位[7-9]，內毒素血癥的發病機制中，可見細胞線粒體內源性氧自由基產生增加及其對線粒體呼吸功能造成氧化損傷，線粒體功能障礙在感染性休克及多器官衰竭的發生發展中都起到了重要作用。雖然目前的實驗研究并未闡明內毒素和尿毒癥毒素對機體具有相同的損傷機制，然而研究顯示CRF末期也出現自由基的明顯升高[10-11]及組織細胞線粒體的結構和功能異常[12-13],作為尿毒癥毒素之一的甲狀旁腺激素(PTH)，能使氧化磷酸化耦聯分離，并損傷心肌細胞線粒體[14]。此外，CRF一直都存在水、電解質及酸堿平衡失調，而線粒體是一種對體液環境敏感的細胞器，容易受其變化而出現異常[15]。無論是自由基的增多還是體液穩態的失調均與細胞器線粒體有密切的關系，因此內毒素及尿毒癥毒素有可能是同一致病機理，即尿毒癥毒素可能也是通過無差別地損害全身組織細胞的線粒體，從而引起全身多系統的廣泛損傷。

實驗結果顯示，CRF模鼠心和小腸細胞線粒體出現明顯腫脹，體內氧化損傷指標MDA升高、抗氧化損傷指標SOD下降，顯示自由基清除酶活性下降，自由基生成過多，引起膜不飽和脂肪酸的脂質過氧化及代謝產物MDA增加，且MDA升高的程度與尿素氮、肌酐的水平呈正相關。血清自由基增多是全身組織細胞自由基增多的間接表現，因CRF時腎小管呈高代謝狀態，而其他組織器官無高代謝，因此可能是由于全身組織細胞的線粒體氧化磷酸化效率下降，使自由基的產生增多。

因此筆者推測，線粒體(中醫之脾)可能是尿毒癥毒素(水濕之邪)的作用靶位。其機理可能與細菌內毒素的致病機理相似，即在尿毒癥毒素作用下損傷了線粒體的功能，使自由基生成過多，進而引起線粒體膜或線粒體DNA(mtDNA)氧化損傷，甚至導致細胞的凋亡，而出現全身多系統、多器官病變的表現，表現為“水濕困脾”之證。

5.3.2“培土制水”法與線粒體培土制水方以太子參、白術、茯苓、生黃芪、陳皮、山楂、大黃、桑椹、當歸、玉竹等藥味組成，太子參、白術、茯苓、生黃芪健脾益氣，陳皮、山楂助脾運化，大黃泄脾濁，桑椹、當歸、玉竹補脾陰，全方具培土制水之功。

實驗顯示，本方可減輕心和小腸細胞受尿毒癥毒素的損害，能減少線粒體形態異常，降低CRF患者血清自由基水平；推測是因為本方有提高細胞線粒體氧化磷酸化效率，減少自由基產生的藥理作用，從而起到保護組織細胞線粒體，減輕受到尿毒癥毒素損害的結果。

研究表明，中藥太子參、黃芪、白術等均能改善細胞線粒體的功能，清除氧自由基[16-18]。大黃能延緩慢性腎功能衰竭的進展[19]，其藥理機制就是大黃素、大黃酸等大黃的有效成份影響了線粒體呼吸功能，從而抑制了腎臟高代謝，減少生成自由基，對腎臟起到保護作用[20]。本實驗表明，培土制水方能保護組織細胞的線粒體(“培土”)，所以明顯減輕尿毒癥毒素對心和小腸細胞及其線粒體的損傷，起到了治療“水濕困脾”證的作用。

5.4小結中醫藏象“脾”的微觀實質是線粒體。機體水液代謝的異常導致組織間隙中的組織液的成份異常，即“水濕”。由于機體組織細胞對組織液的成份高度敏感和依賴，組織液成份的異常導致了組織細胞線粒體的形態和功能異常，這就是“水濕困脾”證的病理學基礎。實驗表明“培土制水”方能保護線粒體、改善線粒體形態和功能，從而達到治療“水濕困脾”證的療效。

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The Research Between "Water Wet Trapped Spleen" Syndrome and the Mitochondria

LIN Hai-min1, ZHENG Min-lin1, RUAN Shi-wei2, DONG Wei-guo1, XIE Yong-cai1, LI Chang-zheng1

1.InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China;

2.TheAffiliatedPeople'sHospital,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China.

Abstract:Objective:To explore the essence of the TCM "spleen" relationship with the mitochondria by studying the pathological basis of the "water wet trapped spleen" syndrome. Methods：Made Model of the rat of "water wet trapped spleen" syndrome by 5/6 nephrectomy. Randomly divided into model group、High-dose treatment group、Small dose treatment group and Sham operation group. Comparison between groups of Scr、BUN、MDA、SOD of change,Observation the change of ultrastructure of heart and small intestine. Results：Results of Scr、BUN、MDA in High-dose treatment group and Small dose treatment group were lower than model group(P<0.05).Result of SOD higer than model group(P<0.05).Ultrastructure of heart and small intestine in electron microscope showed the most lesions in model group.Part of the mitochondria swollen markedly. The mitochondria morphology of treatment group has no obvious change.Conclusion：Speculated that the granule protected the mitochondria and tissue cells by Reducing the membrane lipid peroxidation and free radicals.To test the theory that TCM "Spleen" micro-substance was cell mitochondria provided the experimental basis.

Key words:Water Wet Trapped Spleen; Strengthening Earth to Control Water; Chronic Renal Failure Uremic Toxins; Mitochondria

收稿日期：(2014-12-25)編輯：王河寶

中圖分類號：R256.3

文獻標識碼：B