葛根素對MPP＋誘導的SH-SY5Y細胞凋亡過程中p53和mir-34a表達的影響

趙素晨，程月發，吳慶文，閆春林，郝曉惠

（華北理工大學1．護理與康復學院；2．冀唐學院、3．醫學中心實驗室，河北唐山 063000）

葛根素對MPP＋誘導的SH-SY5Y細胞凋亡過程中p53和mir-34a表達的影響

趙素晨1，程月發2，吳慶文1，閆春林1，郝曉惠3

（華北理工大學1．護理與康復學院；2．冀唐學院、3．醫學中心實驗室，河北唐山 063000）

Effect of puerarin on expression of p53 and mir-34a in apoptosis of SH-SY5Y cell induced by MPP＋

ZHAO Su-chen1，CHENG Yue-fa2，WU Qing-wen1，YAN Chun-lin1，HAO Xiao-hui3

（1．College of Nursing and Rehabilitation of North China Univer-sity of Science and Technology，Tangshan Hebei 063000，Chi-na；2．Jitang College of North China University of Science and Technology，Tangshan Hebei 063300，China；3．Medical Ex-periment Research Center of North China University of Science and Technology，Tangshan Hebei 063000，China）

網絡出版時間：2015－9－14 14：53 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．062．html

近年來，部分以p53為靶點的化合物研究推動著蛋白相互作用和蛋白突變體構象領域藥物的新發現［1］，但有關中藥單體分子對神經細胞退行性變過程中p53及其相關基因變化的研究尚不多見。本研究在前期相關實驗基礎上［2－4］，采用MPP＋誘導的SH-SY5Y細胞凋亡模型，進一步探討葛根素是否通過調節p53及mir-34a表達來影響多巴胺神經細胞凋亡。

1　材料與方法

1．1細胞株 SH-SY5Y細胞株購自中國醫學科學院細胞中心。

1．2主要藥物與試劑 葛根素（中國食品藥品檢定研究院，純度為96%）。MPP＋、Annexin-V／PI和Pifithrin-ɑ（Sigma）；DMEM／F12＝1∶1培養基、胰酶、胎牛血清（Gibco）；GADPH抗體（華安生物），p53抗體（Cell Signaling Technology）；SYBR Green qPCR和反轉錄試劑盒及引物（Invitrogen），引物序列見Tab 1。

Primer nameSequences u6RT primer 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′Forward primer 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′Reverse primer 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′mir-34aRT primer 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACT

GGATACGACACAACCA-3′

GSP 5′-GGGGGAATGGCAGTGTCT-3′R 5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′β-actinForward primer CTTTGAGTTCGGTGGGGTCA Reverse primer GGGCCGTACAGTTCCACAAA p53Forward primer TTTTCCCCTCCCATGTGCTC

Reverse primer CAGTCTGGCTGCCAATCCA

GSP is the specific primer corresponding to miRNA，R is matched with the RT primer。

1．3儀器 CO2培養箱、凝膠成像系統及CFX96 Real-Time Systerm（Bio-Rad），倒置顯微鏡（Olympus），超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），低溫高速離心機（Hitachi），流式細胞儀（FACS Calibuar，BD）。

1．4細胞培養及分組 SH-SY5Y細胞接種于培養瓶中，DMEM／F12培養基（含10%的胎牛血清，青霉素1×105U· L－1，鏈霉素100 mg·L－1），置于37℃、5%CO2培養箱培養。實驗分對照組，MPP＋模型組，葛根素低、中、高（50、100、150 μmol·L－1）＋MPP＋處理組以及Pifithrin-ɑ＋MPP＋處理組，共6組。

1．5流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞用低、中、高劑量的葛根素及40 mg·L－1的Pifithrin-ɑ預先作用3 h后，加入1 mmol·L－1的MPP＋繼續培養24 h，消化，收集，PBS清洗，加入400 μL Annexin V-FITC結合液重懸，加5 μL Annexin V-FITC染料，室溫避光孵育15 min，加10 μL的PI染色液，室溫避光孵育5 min，上機檢測。

1．6Western blot檢測p53蛋白的表達 提取蛋白，測濃度，蛋白變性，SDS-PAGE電泳，轉膜，抗體孵育，ECL顯色，Image J軟件對結果進行分析。

1．7RT-PCR檢測p53及mir-34a基因的表達 提取RNA，測RNA濃度，按反轉錄試劑盒進行cDNA合成，用CFX96 Real-Time Systerm儀進行RT-PCR擴增，實驗結果應用CFX軟件分析。

1．8統計學分析 用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據均用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2　結果

2．1細胞形態學的改變 顯微鏡下觀察，模型組細胞大部分細胞回縮，突起結構減少，細胞變圓，貼壁細胞減少；而葛根素預處理和給予Pifithrin-ɑ干預的細胞形態與模型組比較均有明顯改善。

2．2流式細胞儀檢測細胞凋亡 本次試驗結果與前期的統計分析結果基本趨于一致［4］，葛根素可抑制MPP＋引起的細胞凋亡，與模型組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；給予Pifithrin-ɑ阻斷p53基因表達后，細胞凋亡率與模型組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2．3Western blot檢測p53蛋白表達 模型組與對照組比較，p53蛋白的表達量明顯升高（P＜0.05），而給予葛根素干預后，p53蛋白的表達量又隨葛根素濃度的增高逐漸降低，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。并且，給予Pifithrin-ɑ干預后，p53蛋白表達與模型組比較也明顯降低（P＜0.05）。

2．4RT-PCR檢測p53、mir-34a基因表達 本次檢測p53基因表達結果與前期結果也基本相同，具有統計學分析的一致性［4］；加入p53抑制劑后，p53基因表達與模型組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。模型組mir-34a基因表達量與對照組比明顯升高（P＜0.05），給予葛根素干預后，隨葛根素濃度的增加mir-34a基因表達量與模型組相比又明顯降低（P＜0.05）；給予p53抑制劑阻斷p53基因激活后的mir-34a基因表達量和模型組比較明顯下降（P＜0.05），見Tab 2。

Tab 2 Expression of p53 and mir-34a gene in each group（±s，n＝6）

Tab 2 Expression of p53 and mir-34a gene in each group（±s，n＝6）

＃P＜0．05 vs control group；P＜0．05 vs model group．

Group　p53 gene　mir-34a gene Control　1．00±0．00　1．00±0．00 MPP＋model　1．79±0．08＃　2．02±0．16＃Pifithrin-ɑ　1．10±0．02　1．24±0．2450 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．66±0．03　1．64±0．14100 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．35±0．10　1．45±0．25150 μmol·L－1Pue＋MPP＋　1．19±0．04　1．31±0．20

3　討論

3．1p53-mir-34a反饋調節環路與細胞凋亡 研究表明，miRNA-34家族作為p53的直接調控因子參與了細胞分化、凋亡和衰老等生物學進程，結合有關實驗分析，mir-34a是受p53激活表達水平較高的miRNA。本研究結果，MPP＋使細胞中p53蛋白及p53mRNA的表達增高，且mir-34a基因表達也增高。而加入p53抑制劑干預后的細胞，mir-34a基因表達下降，可能是由于p53水平的降低影響了mir-34a的活性。目前研究發現，mir-34a能夠通過E2F3和SIRT1上調p53，從而形成p53-mir-34a正向反饋調節環路［5－6］。后期我們將繼續進行相關實驗，進一步研究p53與mir-34a的反饋調節關系。

3．2葛根素保護PD的研究 近年來，研究發現葛根素可以抑制由H2O2氧化引起的細胞凋亡［7－8］。體、內外PD模型的相關研究表明，葛根素對p53表達具有一定調節作用［9］，本結果證明葛根素能降低MPP＋引起的細胞凋亡外，還從p53-mir-34a通路角度對葛根素抑制細胞凋亡的機制進行了一些初步新探索，結果顯示，葛根素和p53抑制劑干預使得p53蛋白及p53和mir-34a基因的相對表達較MPP＋模型組降低，提示葛根素有可能通過抑制p53轉錄從而減少mir-34a基因表達。

（致謝：本實驗在華北理工大學醫學中心實驗室完成。感謝老師們實驗過程中的耐心指導，使得本研究順利完成。）

參考文獻：

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中國圖書分類號：R284.1；R329.25；R341；R745.7；R977.6

關鍵詞：帕金森病；葛根素；p53；mir-34a；SH-SY5Y細胞；凋亡

Key words：Parkinson′s disease；puerarin；p53；mir-34a；SH-SY5Y cell；apoptosis

作者簡介：趙素晨（1988－），女，碩士生，研究方向：神經康復學，Tel：0315-3725252，E-mail：zhaosuchen＠126．com；程月發（1967－），男，博士，副教授，研究方向：天然產物藥理學，通訊作者，Tel：0315-8114108，E-mail：arthurcyf＠163．com

基金項目：河北省衛生廳重點醫學研究項目（No 20110160）；河北省中醫藥管理局科研計劃項目（No 2013180）；河北省自然科學基金資助項目（No H2014209300）

收稿日期：2015－06－20，修回日期：2015－08－23

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）10－1479－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．031