‘碭山酥梨’及其褐皮芽變果皮中多胺類物質含量和相關基因表達分析

孫虹麗，王子騰，蔣向紅，賈 兵，劉 莉，葉振風，衡 偉，朱立武

（安徽農業大學園藝學院，合肥230036）

‘碭山酥梨’及其褐皮芽變果皮中多胺類物質含量和相關基因表達分析

孫虹麗，王子騰，蔣向紅，賈 兵，劉 莉，葉振風，衡 偉，朱立武＊

（安徽農業大學園藝學院，合肥230036）

為研究多胺類物質在‘碭山酥梨’芽變品系‘銹酥’果皮褐色形成中的作用，以‘碭山酥梨’和‘銹酥’花后不同時期果皮為試材，采用HPLC方法測定果皮中多胺類物質的含量，利用RACE技術克隆多胺合成過程中的關鍵基因，通過Protparam網站與MEGA5.0軟件分析相關基因蛋白的理化性質及其系統進化，用熒光定量qRT－PCR方法分析不同時期果皮中相關基因的相對表達量。結果表明：（1）除花后50和150d外，其它時期‘碭山酥梨’果皮中腐胺含量均顯著高于‘銹酥’，花后50d、75d、150d時，‘銹酥’果皮中的亞精胺、精胺含量顯著高于‘碭山酥梨’果皮。（2）克隆出多胺合成的基因ADC、SPDS和SPMS（GenBank登錄號分別為KM923903、KM923905和KM923906），預測ADC和SPMS均為水溶性蛋白、SPDS為疏水性蛋白，它們與蘋果的親緣關系最近。（3）熒光定量PCR結果顯示，花后50d，多胺合成中ADC、SPDS和SPMS在‘銹酥’果皮中表達量均顯著高于‘碭山酥梨’。研究推測，‘銹酥’果皮中多胺代謝及相關基因的上調表達可能與‘銹酥’的果皮褐色形成有關。

梨；褐皮芽變；多胺；基因克隆；實時熒光定量

梨屬植物（Pyrus spp.）種質資源按果皮顏色分為綠皮梨（包括綠色、黃色、綠黃色、黃綠色）、褐皮梨（包括綠褐色、黃褐色、紅褐色、褐色等）和紅皮梨（包括部分著色、全面著色）3種類型［1］。‘銹酥’為‘碭山酥梨’的芽變品系，二者果皮顏色存在明顯差異，成熟的‘碭山酥梨’的果皮呈現黃色，而‘銹酥’果皮呈現褐色。有研究表明，梨果皮褐色是由于梨果實發育過程中，果皮角質層和表皮細胞破損后形成的木栓積累而造成的［2］，因此推測梨果皮褐色性狀變異與果皮木栓成分的合成調控有關。李洪缽等［3］的研究發現，金冠蘋果最初的角質層發生龜裂，會深達表皮下的第一層果肉細胞，而形成褐色的木栓組織，逐漸連片成為銹斑。林真二［4］認為，果銹形成的直接原因是由于角質膜的缺失從而導致木栓形成層的發生。吳厚玖［5］認為落花后25d之內是果銹發生的關鍵期。落花后是細胞分裂和幼果快速增長時期，表皮和下表皮細胞最易受到外界的不良刺激而產生果銹。褐色果皮有助于果實抵抗病蟲害和惡劣天氣，更耐貯運［6－7］。

多胺（Polyamines，PAs）是存在于原核生物及真核生物中的具有強生物活性的低分子脂肪族含氮堿，是近年來研究較多的一類植物生長發育調節物質。現已在植物體內發現的多胺類物質就有數十種之多，其中以腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）、尸胺（cadaverine，Cad）及鯡精胺（agmatine，Agm）較為普遍［8］。在多胺的合成代謝中，精氨酸先脫去一分子脲生成鳥氨酸，再由鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）催化脫羧，生成Put。在植物和某些微生物體內，精氨酸被精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）催化脫羧，生成鯡精胺，再經兩步酶促反應，脫去一分子氨，由N－氨甲酰腐胺而生成Put。Put在亞精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）的催化下生成Spd，Spd一方面經精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）催化生成Spm，另一方面經熱精胺合成酶（thermospermine synthase，ACL5）催化生成熱精胺［9］。反應過程中的氨丙基由S－腺苷蛋氨酸脫羧酶（S－adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC）催化S－腺苷蛋氨酸（S－adenosyl－L－methionine，SAM）脫羧產生的脫羧S－腺苷蛋氨酸（decarboxylated S－adenosyl－L－methionine，dcSAM）提供。而S－腺苷蛋氨酸的合成酶（S－adenosyl－L－methionine synthase）是S－腺苷甲硫氨酸合成酶催化甲硫氨酸與ATP生物合成的。它是影響Spd和Spm的一個限速酶［10］，在多胺的分解代謝中主要是通過二胺氧化酶（Diamine oxidases，DAO）和胺氧化酶（Polyamine oxidases，PAO）的氧化作用實現的，亞精胺和精胺可在PAO和DAO的催化下產生H2O2［11］。果實發育是高等植物最重要的生命活動之一，多胺在植物細胞內參與細胞分裂、胚胎發生、生根、開花、種子萌發、花粉管伸長、果實形成及成熟、休眠等生理過程［12］；能穩定DNA、RNA結構，加快轉錄和蛋白質合成，與膜上陰離子基團結合，起穩定膜的作用［13］。目前，有關梨樹多胺物質代謝研究較少，涉及梨樹多胺物質代謝相關基因的表達研究尚未見報道。

本試驗以‘碭山酥梨’和‘銹酥’不同時期果皮為材料，測定了不同時期果皮中Put、Spd、Spm的含量，克隆了多胺合成過程中相關基因ADC、SPDS和SPMS，并分析其在不同時期果皮中表達差異，為研究多胺在芽變‘銹酥’果皮褐色形成中的作用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

樣品采集于安徽省碭山縣園藝場第二分場，植株50年生。2013年花后25、50、75、100、125和150 d，在‘碭山酥梨’和‘銹酥’樹冠的東、南、西、北、中部各隨機摘取2個果實，每個樣品共10個果實，重復3次，0～4℃冷藏保存帶回實驗室。分別切取厚度約為0.5mm外果皮，液氮速凍處理，混合均勻后保存于－80℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 多胺含量的測定 取梨果皮鮮重0.5g，液氮研磨加入2.5mL預冷的5%高氯酸在冰浴中研磨成勻漿，冰浴浸提1h，于4℃下10 000r／min離心30 min，取500μL上清液加入7μL苯甲酰氯和1mL 2 mol／L NaOH溶液，低速渦旋20s，37℃恒溫水浴鍋中避光保溫25min，然后加入2mL飽和NaCl和2 mL冷乙醚，渦旋20s，4℃下10 000r／min離心5 min，取1.5mL醚相于2mL塑料離心管中，放入烘箱中37℃下避光干燥，若仍有苯甲酰氯味道，再加入250μL冷乙醚吹干，殘余物置于－20℃下低溫保存備用。色譜柱為ZORBAX SB－C18柱（Agilent 5μm，4.6mm×150mm），柱溫為25℃，流動相為甲醇∶水＝75∶25，流速為0.4mL／min。待測樣品用100μL 70%甲醇（V／V）溶解，用微孔濾膜過濾（有機系，孔徑為0.45μm），過濾后上機測定，進樣量為20μL，用外標法定量計算，將標準品Put、Spd和Spm經過苯甲酰化后用100μL 60%甲醇配成一系列濃度，每次進樣20μL，用峰面積對進樣量做曲線，計算曲線方程和相關系數。

1.2.2 多胺合成中相關基因的克隆 取花后150d果實的果皮進行總RNA提取，采用（StarSpin Plant RNA Mini Kit）RNA提取試劑盒提取，合成引物3′－CDS，采用Promega公司的反轉錄酶（M－MLV Reverse Transcriptase）合成cDNA，－20℃保存備用。

根據‘碭山酥梨’和‘銹酥’抑制消減文庫中得到的ADC、SPDS、SPMS3個差異表達基因部分核苷酸序列設計引物，利用基因特異性引物ADC－5F／ADC－5R、SPDS－5F／SPDS－5R和SPMS－F／SPMSR，以果皮cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析、回收，連接到pGEM－T載體，將含有目標片段的陽性單克隆送至深圳華大有限公司分別測序，得到ADC、SPDS這2個基因的5′端序列及SPMS的全長序列。設計3′－RACE引物ADC－3F1和ADC－3F2，SPDS－3F1和SPDS－3F2，分別和UPM long、NUP進行巢式PCR擴增，克隆出ADC、SPDS這2個基因的3′端序列。根據5′端和3′端的重疊序列利用DNAMAN軟件進行拼接，最后獲得3個基因的全長序列。本試驗所用引物見表1。

1.2.3 基因蛋白理化性質與系統進化分析 利用Protparam網站（http：／／web.expasy.org／prot－param／），預測ADC、SPDS和SPMS這3個基因編碼蛋白的理化性質。采用MEGA5.0軟件，對預測的ADC、SPDS、SPMS這3個基因氨基酸和NCBI已經登錄相關基因的氨基酸序列進行系統進化分析。

1.2.4 多胺合成中相關基因的表達分析 分別以‘碭山酥梨’和‘銹酥’花后25、50、75、100、125和150d果皮總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈，根據獲得的ADC、SPDS、SPMS基因的3′端序列，使用Primer premier 5.0設計特異性引物YgADC－F和YgADC－R，YgSPDS－F和YgSPDS－R，YgSPMS－F和YgSPMS－R，以梨Actin基因為內參，引物為Actin－F和Actin－R，3次重復。使用STEPONE熒光定量PCR儀進行定量分析，試劑采用TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTMII，操作按照試劑說明進行，采用2－△△CT公式計算基因相對表達量。本試驗中所用引物見表2。

2 結果與分析

2.1 ‘碭山酥梨’與‘銹酥’果皮中3種多胺類物質含量

在花后50d‘碭山酥梨’和‘銹酥’果皮外觀無明顯差異，花后100d兩者果皮色澤開始呈現差別；花后150d兩者果皮外觀差異顯著（圖1），此時‘銹酥’不僅果皮褐變加深，果實可溶性糖、可滴定酸含量也顯著增高。不同時期果皮中Put含量測定結果顯示，在花后各個時期，‘碭山酥梨’和‘銹酥’中Put含量差異均達到顯著水平。除花后50和150d外，其它時期‘碭山酥梨’果皮中Put含量均顯著高于‘銹酥’（圖2，A）。說明果皮中Put提前出現較高的含量，加速了細胞的生理代謝，促進了果皮褐色的形成，增加了果實中可溶性糖、可滴定酸的積累。

Spd含量在花后不同時期，‘碭山酥梨’和‘銹酥’中含量差異均達到顯著水平。在‘碭山酥梨’中呈現先降低、再升高、再降低的趨勢，在‘銹酥’中呈現先升高、后降低、再升高的趨勢。這些可能與前期Put含量的積累有關，在花后50、75和150d，‘銹酥’中的Spd含量要明顯高于其在‘碭山酥梨’中的含量，其他時期均是‘碭山酥梨’中的含量高于‘銹酥’中的含量。在‘碭山酥梨’花后100dSpd含量達到最大值，‘銹酥’中在花后75d達到最大值，過高的Spd將有助于后續Spm的形成（圖2，B）。

不同時期中的‘碭山酥梨’中的Spm含量呈現先降低、后升高、再降低的趨勢，而在‘銹酥’中呈現先升高、后降低、再升高的趨勢。在花后50、75和150d，‘銹酥’中的Spd含量要明顯高于其在‘碭山酥梨’中的含量，其他時期均是‘碭山酥梨’中的含量高于‘銹酥’中的含量。‘銹酥’在花后75dSpm含量達到最大值，‘碭山酥梨’在花后100dSpm含量達到最大值。除了花后25d，其他時期Spm在‘碭山酥梨’和‘銹酥’中的含量差異均達顯著水平，Spd和Spm的變化趨勢較相似。在花后50d時，‘銹酥’果皮中Put、Spd、Spm含量都要高于‘銹酥’果皮中的含量，這種趨勢在Spd和Spm中一直持續到花后75d，可見花后50～100d是‘碭山酥梨’和‘銹酥’產生差異的關鍵時期（圖2，C）。

根據本實驗室前期對‘碭山酥梨’和‘銹酥’不同時期果皮木質素含量的測定數據資料［14］分析，不同時期果皮中多胺的含量與木質素增量呈正相關，但相關關系均未達到顯著水平。說明果皮中木質素積累與多胺的含量變化并不同步。

2.2 多胺合成中相關基因的克隆

ADC基因5’端（圖3，A）和3’端（圖3，B）經過拼接，得到全長cDNA序列2 193bp，編碼527個氨基酸，登錄號為KM923903；SPDS基因5’端（圖3，C）和3’端（圖3，D）經過拼接后得全長cDNA序列909bp，編碼221個氨基酸，登錄號為KM923905；SPMS基因全長cDNA序列1 110bp（圖3，E），編碼242個氨基酸，登錄號為KM923906。

2.3 多胺合成中ADC、SPDS和SPMS基因蛋白理化性質分析

用Protparam預測ADC、SPDS和SPMS基因編碼蛋白的理化性質，推測該3個蛋白的分子式分別為S14和C1600H2831N483O533S21，相對分子質量分別為78 436.9、33 113.9和40 439.4，等電點分別為5.23、4.87和5.98。總帶負電荷的殘基（Asp＋Glu）分別為87、41和46，總帶正電荷的殘基（Arg＋Lys）分別為58、27和39。親水性平均數分別為－0.047、0.016和－0.141，預測ADC和SPMS這2個蛋白均為水溶性蛋白，SPDS為疏水性蛋白。

利用MEGA5.0軟件Neighbor－Joining方法，將ADC、SPDS和SPMS這3個基因的預測蛋白，與GenBank中已經登錄的不同物種相關基因蛋白進行系統進化樹分析（圖4）。ADC基因預測蛋白的進化樹分析中，選擇了蘋果、梅、川桑、葡萄、毛白楊、野茶樹、枳、可可、棉花、蕃茄等，發現ADC基因的預測蛋白與蘋果的親緣關系最近（圖4，A）；SPDS基因預測蛋白的進化樹分析中，選擇了蘋果、梅香瓜、川桑、葡萄、黃瓜、毛白楊、野茶樹、可可、蓖麻等，發現SPDS基因的預測蛋白與蘋果的親緣關系最近（圖4，B）；SPMS基因預測蛋白的進化樹分析中，選擇了蘋果、梅、葡萄、川桑、黃瓜、香瓜、格蘭桉、大豆、擬南芥、甘薯等，發現SPMS基因的預測蛋白與蘋果的親緣關系最近（圖4，C）。

2.4 多胺合成中ADC、SPDS和SPMS基因的表達分析

花后25和50d時，‘銹酥’果皮中ADC基因的表達量均顯著高于‘碭山酥梨’；花后50d‘銹酥’果皮中ADC基因的表達量達到高峰，而‘碭山酥梨’在花后75d達到最大值（圖5，A）。幼果發育前期‘銹酥’果皮中ADC基因的上調表達、‘銹酥’果皮中ADC基因表達量高峰期的提早出現，與其果皮中Put提前出現較高的含量相吻合。

在花75d時，SPDS基因在‘碭山酥梨’中的表達量最高，而在‘銹酥’花后50d時表達量最高。在花后25、50、75和100d時，SPDS在‘銹酥’中的表達量均高于在‘碭山酥梨’中的表達量，這與Spd含量在花后75d達到最大值相吻合，SPDS基因在‘碭山酥梨’和‘銹酥’中的表達趨勢，與Spd含量在‘碭山酥梨’和‘銹酥’中的變化趨勢一致。在花后50和75d時，SPDS在‘碭山酥梨’與在‘銹酥’中的表達量存在顯著差異（圖5，B）。

SPMS基因在‘碭山酥梨’果皮中的表達量呈現先升高、后降低的趨勢，總體變化差異性不大，在‘銹酥’中呈現先升高、后降低的趨勢，在花后50d時，SPMS在‘銹酥’中的表達量最高，這與Spm含量的變化趨勢一致，說明SPMS基因在控制Spm合成的過程中起著正調控作用。在花后25、50、75和125d時，SPMS在‘銹酥’中的表達量均高于在‘碭山酥梨’中的表達量。在花后25和50d時，SPMS在‘碭山酥梨’與在‘銹酥’中的表達量存在顯著性差異（圖5，C）。

對ADC、SPDS、SPMS基因的表達量與Put、Spd、Spm含量作相關性分析，結果顯示，各基因表達量與相關的多胺含量存在正相關關系，但相關性未達到顯著水平。由此可見，基因表達量的上調下調，與其調控的代謝產物的增加或減少，尚存在較復雜的關系。

3 討 論

從多胺代謝途徑可知，多胺在分解代謝中產生H2O2，H2O2參與木質素的合成過程，細胞壁中H2O2會參與多種與胞壁相關的生理過程，如細胞程序性死亡、胞壁木質素的合成和硬化、細胞防御性反應等［15－17］。衡偉等［18］研究發現，花后50和75d，‘銹酥’果皮中的H2O2含量要高于‘碭山酥梨’中的含量。李曉峰等關于‘碭山酥梨’和‘銹酥’研究結果顯示，花后75～125d，是‘銹酥’果皮褐色產生的關鍵時期，其木質素增量要明顯高于‘碭山酥梨’，這可能是導致‘銹酥’果皮褐色產生的原因之一［14］。在衡偉等的研究中，‘碭山酥梨’芽變品系‘銹酥’果皮木質素含量的增加、細胞結構的變化、表皮細胞層木栓程度高，是導致銹酥果皮發生褐變的主要原因［19］。

本研究發現，在果實發育初期，Put在‘碭山酥梨’及‘銹酥’中的含量都較高，但隨后的時期中又達到一個小高峰，但在花后50d時‘銹酥’果皮中Put含量要明顯高于‘碭山酥梨’，而根據多胺在植物中的合成途徑可知，在大部分的生物體內，多胺的合成始于Put合成，它是Spd合成過程中的直接底物，它含量的高低會直接影響后續Spd和Spm含量［20］。在果實發育過程中，坐果期細胞分裂旺盛，Put含量會比較高，‘銹酥’中較高Put含量的積累可能更有利于后期果皮中多胺合成。而在花后75d時，Spd和Spm在‘銹酥’果皮中的含量比在‘碭山酥梨’中的高。過高的Spd和Spm可能對多胺降解產生影響，從而影響H2O2含量。在花后25、50和75d，ADC、SPDS、SPMS在‘銹酥’果皮中的表達量要高于‘碭山酥梨’，在花后50d表達量達到最高，這與前面測定的多胺含量在花后50d時，‘銹酥’果皮中的多胺含量要高于‘碭山酥梨’的結果相一致，由此可見，在花后50～100d多胺的變化，可能在果皮褐色形成過程中起了關鍵作用。

在‘碭山酥梨’與‘銹酥’外觀表現差異的各個時期，兩者果皮中的多胺含量、相關基因的表達也存在差異。因此推測，這些差異可能會對后續多胺分解中H2O2的含量產生影響，繼而影響木質素含量，最后影響到‘銹酥’的果皮顏色形成產生。關于不同時期‘碭山酥梨’和‘銹酥’果皮中H2O2含量，與木質素含量的關系，正在進一步的試驗研究之中。

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（編輯：宋亞珍）

Polyamines Content，Cloning and Expression of the Relevant Genes in Exocarp of‘Dangshansuli’Pear and Its Russet Fruit Mutant

SUN Hongli，WANG Ziteng，JIANG Xianghong，JIA Bing，LIU Li，YE Zhenfeng，HENG Wei，ZHU Liwu＊
（School of Horticulture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

To investigate the mechanism of russet skin formation in pear（Pyrus bretschneideri Rehd.），we used the exocarp of the wild type‘Dangshansuli’and its mutant type‘Xiusu’pear with russet fruits at different days after full bloom（DAFB）as material in this experiment.The content of polyamine was determined by High Performance Liquid Chromatography（HPLC）.The key genes in polyamine biosynthesis were cloned by rapid amplification of cDNA ends（RACE），and their physicochemical properties were conducted by the protocol of Protparam website（http：／／web.expasy.org／protparam／）and the phylogenetic tree of putative proteins was constructed by MEGA5.0software.The relative expressions of ADC，SPDS and SPMSgenes at different stages were analyzed by using real－time quantitative reverse transcription－PCR（qRT－PCR）.The results showed that：（1）The putrescine contents in the exocarp of‘Dangshansuli’was significantly higher than that in‘Xiusu’except for 50and 150DAFB.At 75DAFB，the contents of spermidine and spermine in the exocarp of‘Xiusu’were higher than that in‘Dangshansuli’.（2）The genes of arginine decarboxylase（ADC），spermidine synthase（SPDS）and spermine synthase（SPMS）werecloned，and were submitted to the database of the National Center for Biotechnology Information（NCBI）with the accession number KM923903，KM923905and KM923906，respectively.The structure of putative proteins of ADC，SPDSand SPMSgene in pear was closer to that in apple.ADC and SPMS were all watersoluble by the prediction of their physicochemical properties.The SPDS was water－repellent by the prediction of their physicochemical properties.（3）The levels of relative expressions of ADC，SPDSand SPMSin the exocarp of‘Xiusu’were higher than that in‘Dangshansuli’at 50DAFB.It was postulated that the metabolism of polyamine and up－regulation of relevant genes may be associated with the formation of russet fruit of‘Xiusu’pear.

pear；russet fruit mutant；polyamine；gene clone；relative expression real－time PCR

Q945.6＋4；Q789

A

1000－4025（2015）08－1534－07

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1534

2015－04－27；修改稿收到日期：2015－06－08

國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS－29－14）；國家自然科學基金（31101519）

孫虹麗（1989－），女，在讀碩士研究生，主要從事果樹分子生物學研究。E－mail：sunhongli1212＠163.com

＊通信作者：朱立武，教授，研究生導師，主要從事果樹種質資源與遺傳育種研究。E－mail：zhuliwu＠ahau.edu.cn