胎兒正常胰腺組織Stathmin1的免疫組化和原位雜交研究

黃 敏 張 旭 余 躍 高 萌 賈一夫 胡 聞

·基礎醫學·

胎兒正常胰腺組織Stathmin1的免疫組化和原位雜交研究

黃 敏 張 旭 余 躍 高 萌 賈一夫 胡 聞

目的 探討Stathmin1在胎兒正常胰腺組織中的表達情況。方法收集2012至2014年不同周齡胎兒解剖標本中正常胰腺組織10例，應用免疫組織化學法和原位雜交檢測Stathmin1及其mRNA的表達。結果<24周胎兒正常胰腺組織中Stathmin1已有表達，陽性表達率顯著低于>24周胎兒胰腺的正常組織(54.72%vs82.41%,P<0.05)；且<24周胎兒正常胰腺組織中Stathmin1 mRNA也已有表達，陽性表達率顯著低于>24周胎兒胰腺的正常組織(48.33%vs73.64%,P<0.05)。結論胎兒正常胰腺組織Stathmin1已有表達，隨著胎兒的發育而發生變化，其可能參與了胎兒胰腺組織的生長發育。

胎兒；胰腺組織；Stathmin1; 原位雜交；免疫組化

Stathmin1蛋白是一種微管不穩定磷蛋白，在細胞周期對微管系統動力平衡的調節發揮重要作用。研究則表明Stathmin1蛋白在許多類型的人類惡性腫瘤中呈高水平表達，如口腔癌、食道癌、胃癌等[1]。但其在胎兒胰腺組織表達，國內外鮮見報道。本研究應用免疫組化和原位雜交技術觀察胎兒正常胰腺組織Stathmin1的表達，為探討Stathmin1的生理功能提供形態學依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源 本研究選取2012至2014年安徽省立醫院病理科標本庫中的10例11～37周胎兒解剖標本，其中4例<24周,6例>24周。胎兒解剖標本若有胰腺疾病或繼發性胰腺損傷破壞胰腺正常結構完整的病例則剔除。

1.2 主要試劑與探針 鼠抗人Stathmin1 抗體[EP1573Y]ab52630(上海Abcam公司)，濃縮型DAB試劑盒(產品編號ZLI-9017/9018/9019，中杉金橋公司)。Stathmin1 mRNA原位雜交試劑盒(武漢博士德公司，產品編號 MK1814-h),Stathmin1基因寡核苷酸探針序列：5′-TCTT TCACC TGGAT ATCAG AAGAA GCCAT-3′。

1.3 原位雜交檢測 石蠟切片經二甲苯常規脫蠟，梯度乙醇脫水。3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，室溫下處理30 min。蒸餾水沖洗3次，每次5 min。暴露mRNA的核酸片段，用新鮮配制的胃蛋白酶(1 mL 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶混勻)，在37℃下消化10～30 min。用0.5 M PBS沖洗3次，每次5 min。再用蒸餾水沖洗1次，5 min。濕盒的準備：干的雜交盒底部加20%甘油20 mL以保持濕度。預雜交：滴加預雜交液 20 μL/片在42℃恒溫箱內孵育4 h。雜交：甩去多余的液體，滴加雜交液 20 μL/片，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上，在42℃恒溫箱內孵育14 h。雜交后洗滌：揭開蓋玻片，在30～37℃水溫的2×SSC 沖洗5 min×2次，0.5×SSC 沖洗15 min×1次, 0.2×SSC 沖洗15 min×1次。滴加封閉液，20 μL/片置于37℃ 30 min，甩去多余液體，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60 min。0.5 M PBS沖洗4次，每次5 min。滴加SABC：37℃ 20 min。0.5M PBS沖洗3次，每次5 min。滴加生物素化過氧化物酶：37℃ 20 min。0.5M PBS沖洗4次，每次5 min。DAB顯色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.4 免疫組織化學染色 脫蠟、水化組織切片。標本置于3%H2O2的去離子水孵育5 min,以阻斷內源性過氧化物酶。PBS沖洗5 min,共3次。滴加Stathmin1抗體(1 ∶100)于切片上37℃孵育2 h，PBS沖洗2 min,共3次。滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育15 min, PBS沖洗2 min,共3次。將DAB底物工作液滴加于切片上，顯微鏡下控制顯色，自來水終止顯色反應。蘇木素復染，常規酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。陰性對照：以PBS代替一抗，其余步驟與上述相同。

1.5 結果判定 Stathmin1及其mRNA陽性信號細胞胞漿著色呈棕黃色，高倍鏡下隨機選取5個視野(每個視野觀察細胞數不少于200個)，按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結果判定[2]。①按細胞著色深淺評分：0分，細胞無顯色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。②按陽性細胞數百分比：<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分。取①、②兩項評分的乘積作為總積分，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.6 統計學方法 數據采用SPSS 16.0進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎兒正常胰腺組織Stathmin1的表達 Stathmin1陽性顯色為棕黃色顆粒，位于胞質，見圖1。在>24周胎兒正常胰腺組織中呈較高表達，陽性表達率分別為82.41%；而<24周胎兒正常胰腺組織中已有表達，陽性表達率分別為54.72%；兩者差異有統計學意義(χ2=8.59,P=0.001)。

2.2 胎兒正常胰腺組織Stathmin1 mRNA的表達 Stathmin1 mRNA在>24周胎兒正常胰腺組織中表達較強，呈彌漫性著色，陽性顯色位于胞漿，呈棕黃色顆粒，見圖2。Stathmin1 mRNA在>24周胎兒正常胰腺組織中陽性表達率為73.64%，在<24周胎兒正常胰腺組織中已有表達，陽性表達率為48.33%，兩者差異有統計學意義(χ2=7.45,P=0.003)。

3 討論

Stathmin1是近來研究較多的微管不穩定蛋白，在大量的組織和物種中均廣泛存在。它與細胞有絲分裂紡錘體的結構和功能關系密切。目前已經證實Stathmin1在包括消化系統惡性腫瘤等多種惡性腫瘤細胞中高水平表達[1]。但目前胎兒正常胰腺組織中Stathmin1 表達的相關研究鮮見報道。

本研究發現，Stathmin1陽性顯色為棕黃色顆粒．位于胞質。在>24周胎兒正常胰腺組織中呈較高表達，陽性表達率顯著高于<24周胎兒胰腺的正常組織(P<0.05)；且Stathmin1 mRNA在>24周胎兒正常胰腺組織中表達較強，呈彌漫性著色，陽性顯色位于胞漿，呈棕黃色顆粒。Stathmin1 mRNA在>24周胎兒正常胰腺組織中陽性表達率顯著高于<24周胎兒胰腺的正常組織(P<0.05)。胎兒正常胰腺組織Stathmin1 已有表達，隨著胎兒的發育而發生高表達，其可能在胎兒胰腺組織的生長發育中發揮了重要作用。

在正常人體組織中，Stathmin1表達水平在具有較高細胞代謝能力的組織中高，而在較低增殖能力的組織中表達較低。Hanash等[3]在HL60白血病細胞中發現Stathmin1表達明顯增高，當細胞被誘導發生分化和細胞增殖明顯減慢時，細胞中Stathmin1表達水平降低。在其他幾個白血病細胞系中也發現細胞增殖停滯并分化較好時，Stathmin1表達水平降低。Guo等[4]發現，大鼠骨骺干細胞內Stathmin1表達水平高時，細胞增殖；Stathmin1表達被抑制時，細胞增殖減弱，并且發生細胞分化。還有研究發現在神經元細胞、再生的肝細胞、反應性增生的淋巴結細胞等增殖細胞中Stathmin1表達上調[5]，這些與本研究結果一致。

[1] Akhtar J,Wang Z,Jiang WP,et al.Stathmin overexpression identifies high risk for lymphaticmetastatic recurrence in pN0 esophageal squamous cell carcinoma patients[J]. J Gastroenterol Hepatol,2014,29(9):944-950

[2] Gfroerer S,Metzger R,Fiegel H, et al.Differential changes in intrinsic innervation and interstitial cells of Cajal in small bowel atresia in newborns[J].World J Gastroenterol,2010,16(45):5716-5721.

[3] Hanash SM,Strshler JR,Kuick R,et al.Identification of a polypeptide associated with the malignant phenotype in acute leukemia[J].J Biol Chem,1998,273(26):12813-12815.

[4] Guo F,Zhang Y,Chen AM.Effect of Stathmin decoyoligode oxynucIeotjdes on the proliferation and differentiation of precartilainous stem cells[J]. J Huazhong Univ Sci Technol,2007,27(5):557-560.

[5] Niethammer P,Bastiaens P,Karsenti E.Stathmin-tubulin interaction gradients in motile and mitotic cells[J].Science,2004,303(5665):1862-1866.

(2014-11-01 收稿 2014-12-17 修回)

Expression of stathmin 1 in normal fetal pancreatic tissues

HuangMin,ZhangXu,YuYue,etal

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuimedicalUniversity,Hefei230001,China

Objective To explore the expression of stathmin 1 in the normal fetal pancreatic tissues.MethodsFrom 2012 to 2014, 10 fetal specimens of normal pancreatic tissues from dead fetus at different weeks were collected, and the expression of stathmin 1 and its mRNA were detected and observed by immunohistochemistry and in situ hybridization.ResultsThe positive expression rate of stathmin 1 in fetal specimens of pancreatic tissues less than 24 weeks was lower than that of more than 24 weeks (54.72%vs82.41%,P<0.05), so was it with the positive expression rate of Stathmin 1 mRNA in fetal specimens less than 24 weeks (48.33%vs73.64%,P<0.05).ConclusionThe expression of stathmin 1 exists in normal fetal pancreatic tissues, and its expression increases along with developing fetus. It suggests that stathmin 1 may be involved in the development of fetal pancreatic tissues.

Fetus; Pancreatic tissues; Stathmin 1; In situ hybridization; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.02.001