枯草芽孢桿菌YA-3對番茄早疫病的防治作用

張曉琴，張 曉，何曉銳，牛明楊，黃建新

(西北大學 生命科學學院，陜西 西安 710069)

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枯草芽孢桿菌YA-3對番茄早疫病的防治作用

張曉琴，張 曉，何曉銳，牛明楊，黃建新

(西北大學 生命科學學院，陜西 西安 710069)

從西洋參種植土壤中分離獲得一株具有抗真菌活性的細菌YA-3，杯碟法測定表明，該拮抗菌對13種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，其中對番茄早疫病抑制率達82.2%；YA-3培養濾液可導致番茄早疫病病原菌菌絲畸變、枯萎或者斷裂，阻礙菌絲生長，并能夠抑制其孢子萌發，抑制率達92.3%以上；利福平抗性標記試驗表明，YA-3在番茄葉片上有很強的定殖能力，第26 d仍能檢測到該菌；經盆栽試驗結果表明，YA-3發酵液可使番茄葉片發病率顯著降低，防治效果可達到75.52%；根據其形態、生理生化特性及16S rDNA同源性分析結果，鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

番茄早疫病；枯草芽孢桿菌；拮抗作用；生物防治

番茄早疫病又稱輪紋病,由茄鏈格孢菌Alternariasolani引起,發生在葉、莖、葉柄及果實上,病害嚴重發生時可引起落葉、落果及斷枝[1],該病對番茄產量的影響很大,生產上常年減產20% ～ 30%,嚴重時達50%以上,甚至絕產[2]。目前,生產上主要以化學藥劑進行防治,但化學防治所帶來的抗藥性、農產品的農藥殘留以及環境污染等副作用已引起人們的高度重視[3-4],應用有益微生物對番茄早疫病進行生物防治變得十分重要。例如，印度Khan利用類芽孢桿菌B-30488r發酵液噴灑番茄葉面,使早疫病的發病率減少了45.3%[5],周防震從果實表面篩選出對番茄早疫病菌有拮抗作用的酵母菌,對3個品種的番茄早疫病平均抑制率達77.8 %[6]。本研究針對番茄早疫病病菌抗藥性、化學防治的現狀,從西洋參種植土壤中分離篩選到一株具有廣譜抗真菌活性的拮抗細菌YA-3,研究其對番茄早疫病病原菌菌絲及孢子萌發的影響。在室外條件下利用抗利福平標記試驗及盆栽試驗初步探索該拮抗菌對番茄早疫病的防治效果,并通過形態、生理生化特性及16S rDNA序列分析,對其進行了鑒定,以期為植物病害的防治提供新的高效生防菌株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 拮抗細菌YA-3:分離自陜西留壩西洋參種植土壤,牛肉膏蛋白胨斜面保存于4℃。

供試植物病原菌:番茄早疫病(Alternariasolani)、甜椒早疫病(Alternariasolani)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)、馬鈴薯早疫病(Alternariasolani)、致甘薯干腐病(Fusariumsolani)、致輪紋病(Macrophoma)、番茄晚疫病(Phytophthorainfestans)、郁金香種球腐爛病(Trichodermasp.)、甜菜黑斑病(Alternariaalternata)、棗炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)、小麥赤霉病(Gibberellasaubinetti)、棉花枯萎病(Fusariumoxysporium)、西洋參立枯病(Rhizoctoniasolani),由陜西省微生物研究所提供。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基用于培養拮抗菌株,PDA培養基用于供試病原真菌的培養[7]。

1.2 抑菌譜的測定

將保存的拮抗菌YA-3在牛肉膏蛋白胨斜面上30℃恒溫培養48 h進行活化,然后接種于其液體培養基中,150 r/min 30℃恒溫培養48 h,即得發酵液,發酵液經8 000 r/min離心10 min,取上清經0.22 μm濾膜過濾得無菌發酵液。

采用杯碟法,將供試病原菌分別接種在PDA培養基中央,然后在離病原菌2.5 cm處十字交叉對稱放置4個牛津杯,各向其中加入150 μL YA-3無菌發酵液,同時以加入150 μL無菌液體培養基作對照,恒溫28℃培養,待對照組病原菌長滿平皿時測量抑菌圈直徑大小,按下式計算菌落生長抑制率,每個處理重復3次。

菌落生長抑制率(%)=

1.3 對番茄早疫病菌絲及孢子萌發的影響

1.3.1 對菌絲的影響 以番茄早疫病病原菌為指示菌,試驗組參照1.2杯碟法,對照組僅接種番茄早疫病病原菌,28℃恒溫培養5～6d后,分別挑取抑菌帶邊緣菌絲以及對照組菌絲,水浸片法制片,光學顯微鏡觀察對比菌絲形態。

1.3.2 對孢子的影響 番茄早疫病孢子懸液的制備,即在已培養7 d的番茄早疫病平板上加入適量無菌水,洗下孢子并用0.45 μm濾膜過濾,除去菌絲,稀釋制成1×105個/mL孢子懸液備用。無菌凹玻片上先滴加40 μL上述孢子懸液,再加入等量的YA-3無菌發酵液,蓋上蓋玻片,28℃保濕培養。以孢子懸液混合無菌液體培養基作為對照,每隔12 h隨機檢測100個孢子的萌發情況,計算孢子萌發抑制率。每組試驗重復3次。

孢子萌發抑制率=(未萌發孢子數/檢測孢子總數)×100%。

1.4 YA-3在番茄葉片上定殖動態研究

1.4.1 抗利福平標記菌株的篩選及其菌液制備采用抗藥性標記法測定拮抗菌在番茄葉片上定殖動態,即先將YA-3培養液轉入含l00 μg/mL利福平的牛肉膏蛋白胨平板上,30℃培養48 h。挑取長出的菌落,再將其轉入含200 μg/mL利福平的牛肉膏蛋白胨平板上。依此方法直至篩選出能在含有400 μg/mL利福平的牛肉膏蛋白胨平板上正常生長,且菌落形態以及對病原菌的拮抗作用保持不變的利福平標記菌株,將其接入含400 μg/mL利福平的牛肉膏蛋白胨液體培養基中。在30℃ 150 r/min 培養48 h,稀釋得1×l08cfu/mL發酵液備用。

1.4.2 菌株YA-3在番茄葉片的定殖 隨機抽取同株齡盆栽番茄,設以下3組處理:第1組,均勻噴灑上述制得的YA-3發酵液;第2組,先噴灑YA-3發酵液,2 d后葉片接種1×105個/mL早疫病病原菌孢子懸液;第3組,番茄葉片先接種病原菌孢子懸液,葉片發病后(即2 d后),噴灑YA-3發酵液。以噴灑無菌液體培養基作對照,每組在處理后的0 d，2 d，5 d，8 d，12 d，16 d，18 d，20 d，22 d，24 d，28 d,隨機抽取3片葉片,截取1 cm2葉片組織于無菌生理鹽水中反復振蕩漂洗,梯度稀釋涂布于含400 μg/mL利福平的平板上,48 h后計數,每個處理設3個重復。

1.5 盆栽試驗

盆栽番茄植株挑選生長狀態近似、接近開花期植株進行以下4組處理:①對照組,只接種番茄早疫病病原菌孢子懸液;②70%(質量分數)百菌清1 000倍稀釋液;③保護作用組,先均勻噴灑1×l08cfu/mL的YA-3發酵液,2 d后接種病原菌孢子懸液;④治療作用組,先接種病原菌孢子懸液,2 d后植株發病時,均勻噴灑1×l08cfu/mL的YA-3發酵液。每組處理5株番茄植株,并設3次重復。接種番茄早疫病病原菌時先將葉片表面針刺,然后將1×105個/mL的病原菌孢子懸液噴灑于番茄葉表面,保濕培養14 d,隨機抽取10片葉片,記錄發病情況,計算病情指數、防治效果。病葉分級標準,以葉片病斑面積占整個葉面積的百分率來分級:0級,無病;1級,出現病斑,病斑的感染面積為葉面總面積的1/4以下;2級,出現病斑,病斑的感染面積為葉面總面積的1/4-1/2;3級,出現病斑,病斑的感染面積為葉面總面積的1/2-3/4;4級,出現病斑,病斑的感染面積為葉面總面積的3/4以上。

1.6 拮抗菌YA-3鑒定

1.6.1 形態及生理生化鑒定 菌株的形態特征及生理生化特性分析參照細菌鑒定的常用方法[8-9]。

1.6.2 分子生物學鑒定 采用酚/氯仿法提取菌株YA-3基因組總DNA,細菌通用引物Primer 1(27 F):5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和Primer 2(1495R):5′-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3′,進行16S rRNA全長擴增。PCR 反應體系(25μL)為: 2×Ex Taq Master Mix 12.5 μL,Primer 1和Primer 2各1 μL;Temple 1 μL;加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為:94℃預變性3 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min,共27個循環;最后72℃延伸5 min。反應結束后用1.5%(體積分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后,經北京奧科生物工程技術服務有限公司測序。

1.7 數據分析

試驗數據采用統計分析軟件SPSS18.0進行分析,不同處理間的差異顯著性用Duncan氏新復極差法檢驗。

2 結果與分析

2.1 抑菌譜測定結果

杯碟試驗結果表明,拮抗菌YA-3對供試的13種植物病原菌均有抑菌作用。其中，對番茄早疫病、甜椒早疫病及番茄灰霉病拮抗能力最強,對指示菌番茄早疫病抑菌圈直徑達35.5mm,抑菌率達83.89%(見表1),且形成抑菌圈后繼續培養12天抑菌圈大小不變。這表明該拮抗細菌具有拮抗能力強、抑菌譜廣、抑菌性能穩定的特性。

表1 YA-3對供試病原真菌的抑制作用(平均值±標準差)Tab.1 The inhibition of YA-3 on pathogen fungal(Mean±SD)

2.2 對番茄早疫病病原菌生長的影響

與對照組相比,試驗組病原菌菌絲異常,出現了溢縮,破裂的現象,有的部位還發生了畸變(見圖1)。YA-3無菌發酵液對番茄早疫病病原菌孢子有明顯的抑制作用(見圖2)。對照組培養12 h孢子萌發正常,48 h孢子萌發長出芽管;處理組病原菌孢子培養12 h,孢子未能萌發,培養至48 h孢子仍不萌發或萌發的孢子出現畸形,孢子萌發抑制率達92.3%。這表明拮抗菌YA-3的代謝物能夠導致菌絲、孢子畸形,抑制病原真菌菌絲生長及孢子的萌發。

圖1 YA-3對番茄早疫病病原菌菌絲影響Fig.1 Effect of YA-3 on mycelium of tomato early blight pathogen

圖2 YA-3發酵液對番茄早疫病病原菌抱子的影響Fig.2 Effect of YA-3 ferment liquid on spores of tomato early blight pathogen

2.3 菌株YA-3在番茄葉片的定殖動態

拮抗菌在植物葉片的定殖試驗結果表明,第1組僅噴拮抗菌發酵液組,在26 d后檢測不到拮抗菌YA-3的存在;第2組先噴拮抗菌發酵液組,YA-3在番茄葉片的定殖數目顯著高于第1組,在第8 d到第12 d菌體數量較穩定,且第26 d仍能檢測到其存在;第3組先接病原菌組,YA-3定殖數目最初階段呈下降趨勢,然后逐漸上升,在最大值處維持3 d后減少,可定殖18 d,而對照組檢測不到拮抗菌(圖3)。結果表明，先噴拮抗菌發酵液再接病原菌組拮抗菌YA-3的定殖時間及數量高于其他試驗處理組,拮抗菌發酵液處理時間不同，對其在番茄葉片的定殖有顯著影響。

圖3 YA-3在番茄葉片上的定殖動態Fig.3 The colonization dynamics of YA-3 on phylloplane of tomato

2.4 室外盆栽試驗

室外盆栽試驗進一步證實該YA-3對番茄早疫病有較好的防治效果。由表2結果可見,處理14 d后,保護作用組,番茄早疫病發病率及病情指數分別為18.80%和12.42,防治效果顯著高于治療作用組及70%(質量分數)百菌清1 000倍稀釋液,可達75.52%。70%(質量分數)百菌清1 000倍稀釋液的防效與治療作用組相當。結果表明，拮抗菌YA-3發酵液對番茄早疫病有一定的防治效果,對植株起到了一定的保護作用。

表2 YA-3對盆栽番茄早疫病的防治效果Tab.2 Control efficacy of YA-3 on potted tomato early blight

2.5 菌株YA-3鑒定結果

菌株YA-3在牛肉膏蛋白胨培養基上30℃培養24 h,菌落呈圓形,中心凹,米黃色,表面較濕潤,邊緣整齊,菌體呈桿狀,大小約3.4 μm×0.7 μm,革蘭氏陽性菌,48 h后產生芽孢,芽孢中生。生理生化測定特征為接觸酶、V-P反應陽性,吲哚陰性,可水解明膠、淀粉及酪素,利用檸檬酸鹽,不利用丙酸鹽,可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖且產酸。

測序結果顯示,菌株YA-3序列長度為1455bp(GenBank登錄號:KM497438,在NCBI數據庫上進行BLAST比對。結果表明，該菌株與芽孢桿菌屬菌株同源性最高,選取芽孢桿菌屬9個模式菌株,用軟件MEGA 5.0構建系統發育樹,菌株YA-3與Bacilllus subtilis聚于同一分支中(圖4)。結合形態學和生理生化特征及16S rDNA分析結果,將拮抗細菌YA-3鑒定為枯草芽孢桿菌Bacilllussubtilis。

圖4 YA-3 16S rDNA序列系統發育樹Fig.4 The 16S rDNA sequence phylogenetic tree of YA-3

3 討 論

隨著人們對環境和食品安全要求的提高,開發對人類和環境友好、并具良好防治效果的、新的生物農藥已經成為當前的研究熱點。由于枯草芽孢桿菌是自然界廣泛存在的非致病菌,對人畜無害,不污染環境,并且能產生多種抗菌素和酶,具有極強的抗逆能力和對多種植物病害具較好防效,吸引大量學者開展研究,國外和國內已經開發出多種生防芽孢桿菌制劑,并廣泛應用于生產。目前，國內用以防治番茄早疫病菌生防菌劑均還處于實試室研究階段或小試階段,因此開發新的生防資源具有一定的意義。

本試驗室從西洋參種植土壤中分離得到一株拮抗細菌YA-3,經形態、生理生化特性及16S rDNA同源性分析結果,鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),牛津杯試驗表明，該菌株不但對番茄早疫病有顯著的拮抗作用,同時對多種植物病原真菌均有明顯的抑制作用。該拮抗菌的發現,為生物防治植物病害提供了新的、有效的生防資源,具有良好的應用前景。

本文主要研究了YA-3對番茄早疫病的生防作用,結果顯示該拮抗細菌的代謝產物能夠導致番茄早疫病病原菌菌絲溢縮、破裂,孢子畸形。這說明YA-3能代謝產生一種拮抗物質,抑制菌絲生長、孢子萌發,該拮抗物質有待進一步研究。通過YA-3在番茄葉片上定殖動態研究表明,該拮抗菌在番茄葉片有良好的定殖能力,其中先噴灑發酵液組拮抗菌的定殖數目最多、定殖時間最長,且室外盆栽試驗顯示保護作用組即先噴發酵液再接病原菌,對番茄早疫病的防治效果最好。這與Benizri[10]，Bloemberg[11]有關于生防菌株在田間的定殖能力是生物防治效果關鍵的報道相一致。此外，盆栽試驗也表明拮抗菌YA-3發酵液對已發病植株也有良好的防治效果。這些為該拮抗菌應用于農業生產奠定了基礎。

本研究表明YA-3是一株在番茄葉片有良好定殖能力并對番茄早疫病有良好防治效果的拮抗菌,具有較高的生防價值和田間應用前景,值得進一步研究。然而，在自然條件下生防菌的防治效果受多種因素的影響,因此，菌株YA-3對植物病菌在大田條件下的防治效果還有待于進一步研究。

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(編 輯陳鐿文)

Control efficacy ofBacillussubtilisYA-3 on tomato early blight

ZHANG Xiao-qin, ZHANG Xiao, HE Xiao-rui, NIU Ming-yang, HUANG Jian-xin

(College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069, China)

Biocontrol bacterial YA-3 was isolated from the soil of American ginseng planting in Shaanxi Liuba.The results of the antagonistic tests by cylinder plate methods showed that there were 13 kinds of plant pathogens inhibited in different degrees by fermentaion broth of the antagonistic bacteria, the inhibited rate of tomato early blight reached 82.2%.The culture filtrate of YA-3 can lead to the pathogen hyphae of tomato early blight distortion,wither or fracture and inhibit the growth of mycelia.Additionally, the inhibition rate of the spore germination was more than 92.3%.Determining of the colonization by the signed rifampicin-resistance in YA-3 showed that it could colonize well in tomato leaves, the group which sprayed the fermentation broth of YA-3 firstly was found to have the longest colonization time and the existence of antagonistic bacteria can still be detected within 26 days.The pot experiment revealed that the control effect reached 62.43%.It was identified asBacillussubtilison the basis of morphological, physiological and biochemical characters as well as the sequence analysis of 16S rDNA.

tomato early blight;Bacillussubtilis; antagonism; biocontrol

2014-10-25

陜西省自然科學基金資助項目(SJ08ZT08-2)

張曉琴，女，甘肅蘭州人，從事微生物資源利用研究。

黃建新，女，陜西西安人，西北大學教授，從事微生物資源應用研究。

Q939.95

：ADOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2015-03-015