饑餓及復投喂對大黃魚肌肉生長抑制素1型和2型基因表達的影響

韓明星 薛良義

(寧波大學海洋學院, 浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協同創(chuàng)新中心, 寧波 315211)

饑餓及復投喂對大黃魚肌肉生長抑制素1型和2型基因表達的影響

韓明星 薛良義

(寧波大學海洋學院, 浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協同創(chuàng)新中心, 寧波 315211)

采用熒光實時定量 PCR技術研究饑餓及復投喂對大黃魚不同組織中兩型肌肉生長抑制素(Myostatin, MSTN)基因表達的影響。結果顯示, 肌肉中MSTN-1和MSTN-2在饑餓0—35d期間, 表達量先升高后降低, 分別在21d和28d達到最高, 復投喂時期逐漸下降; 腦中兩型MSTN表達變化不同, 但都在饑餓35d表達量最低, 復投喂時期表達顯著上升, 與對照組有顯著差異; 脾臟中MSTN-1在饑餓28d表達量最高, MSTN-2在饑餓21d表達量最高, 復投喂時期表達都逐漸降低; 腎臟中兩型MSTN表達變化相似, 都在饑餓21d降到最低,然后升高; 腸中1型和2型分別在饑餓14d和7d表達量最低, 在28d表達量都達到最高; 肝臟中兩型MSTN都是在饑餓21d表達量最低, 之后顯著升高, 復投喂時期表達上升。結果提示兩型MSTN在不同組織中的功能可能存在差異。

大黃魚; 肌肉生長抑制素基因; 熒光實時定量PCR; 饑餓; 復投喂

1997年, McPherron等[1]在小鼠(Mus musculus)骨骼肌中發(fā)現TGF-β超家族(Transforming growth factor-β superfamily, TGF-β)成員肌肉生長抑制素(Myostatin, MSTN), 又稱生長分化因子8(Growth and differentiation factor-8, GDF-8), 具有抑制肌肉細胞增殖和分化的功能, 敲除該基因的小鼠, 骨骼肌重量明顯增加。在MSTN過表達的轉基因小鼠中, 肌肉量明顯降低[2]。比利時蘭牛(Bos taurus)由于MSTN基因突變, 出現“雙肌”表型[3]。近年來, 陸續(xù)在人(Homo sapiens)[4]、狗(Canis lupus familiaris)[5, 6]、羊(Ovis aries)[7]體內發(fā)現由于MSTN基因突變而導致肌肉肥大的現象, 而且很多的研究表明MSTN在魚類肌肉增殖和分化過程中也起著十分重要的作用[8—10]。

哺乳動物的 MSTN主要在骨骼肌中表達[1], 在乳腺[11]、心臟[12]等組織中的表達量很低。與哺乳動物不同, 某些魚類存在兩種類型的 MSTN, 且表達范圍更加廣泛, 如斑馬魚(Danio rerio)[13]、金鯛(Sparus aurata)[14, 15]等魚類中存在 MSTN-1和MSTN-2, MSTN-1在肌肉、腦、腸、心臟、肝臟等組織中廣泛表達, MSTN-2的表達則有一定的特異性,但普遍在腦中高度表達[14—16]。

在自然環(huán)境中, 由于環(huán)境變化或者食物分布不均等, 魚類經常會受到高、低溫, 或者饑餓等環(huán)境因素的影響, 進而影響其生理機能。研究表明 MSTN的表達也會受環(huán)境的影響, 低溫和養(yǎng)殖密度的增大分別可以使鯰(Ictalurus punctatus)[17]和斑馬魚[18]中MSTN-1的表達發(fā)生變化, 而饑餓會影響金鯛[19]、黑鱸(Dicentrarchus labrax)[20]和尖吻鱸(Lates calcarifes)[21]等魚類中MSTN的表達。

大黃魚是我國主要的海水養(yǎng)殖魚類之一, 具有較高的經濟價值。在越冬養(yǎng)殖期間, 很長一段時間停止喂食, 但禁食對大黃魚生理機能影響的研究報道很少。本文在已克隆到大黃魚MSTN-1(AY842933) 和 MSTN-2(EU571244)基因的基礎上, 研究不同饑餓時段及復投喂對大黃魚肌肉、腦、脾、腎、腸、肝臟等6個組織中兩型MSTN基因表達的影響, 初步探討了兩型MSTN基因在不同組織中的表達變化,為研究兩型基因的功能差異提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

100尾大黃魚購自寧波海灣水產苗種繁育中心,體重(111.51±6.24) g, 暫養(yǎng)于網箱(3 m×3 m×3 m)中,投喂冰鮮魚, 每天在早上5點和下午5點各1次。達到飽食狀態(tài)后不再投喂, 暫養(yǎng)一周后, 進行分組,隨機選取40條作為對照組。實驗期間對照組正常投喂, 實驗組不投喂, 取樣時間為饑餓1d、7d、14d、21d、28d、35d、復投喂7d和14d, 饑餓0d從對照組中取樣, 復投喂在饑餓 35d后進行。前三次取樣均取對照組, 將其與饑餓0d相比, 表達量無顯著差異, 故用饑餓0d的表達水平來代表對照組。實驗從10月持續(xù)到11月, 水溫 (20—23)℃, 每次取樣時從中隨機取3尾, 每尾魚取其肌肉、腦(整個腦組織)、脾、腎、腸和肝組織, 裝于1.5 mL離心管(RNasefree),迅速置于液氮中, 后轉至–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

總RNA的提取 從–80℃超低溫冰箱中取出大黃魚組織樣品, 采用上海生工生物工程有限公司的Trizol試劑, 按照說明書提取各組織總RNA, 提取的總 RNA經 Dnase Ⅰ(寶生物工程(大連)有限公司)處理去除 DNA污染, 之后采用 1%瓊脂糖凝膠(上海生工生物工程技術服務有限公司)電泳檢測總RNA完整性, 并用NanoDrop超微量紫外分光光度計(美國托摩根科技有限公司)測定總RNA濃度。

反轉錄合成 cDNA 根據 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(寶生物工程有限公司)說明書建立反轉錄體系, 參照薛良義等[22]方法進行反轉錄。

引物設計 根據本實驗室克隆到的 MSTN-1 (AY842933)和MSTN-2(EU571244)序列, 設計MSTN-1的引物 My1F 5′-TCCCTGAAGATCGACGTGAA-3′和My1R 5′-TTTGGGGCAATAATCCAGTC-3′; MSTN-2的引物My2F 5′-CCATAGTATCAAGTCCCAGATC C-3′和My2R5′-TGAACAGGCAGCAGGAGGACAA C-3′; 內參β-actin引物βactinF 5′-CCAGATCATGTT CGAGACCTTC-3′和βactinR 5′-GAACCTCTCATTG CCAATGGTG-3′, 由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

饑餓及復投喂時期MSTN-1和MSTN-2在不同組織中的表達檢測 每個時期每個樣品重復3次,采用 qPCR, 反應在 Eppendorf Mastercycler?eprealplex 實時熒光定量 PCR儀中進行, 體系為: SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)(寶生物工程(大連)有限公司)12.5 μL, PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.5 μL, PCR Reverse Primer (10 μmol/L)0.5 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 10.5 μL, Total Volume 25 μL, 兩步法進行擴增, 并且增加熔解曲線以驗證反應的特異性, 反應程序為95℃預變性1min, 95℃變性40s, 58℃退火40s, 40個循環(huán), 熔解曲線(55—95)℃。此外, 還檢測了目的基因和內參的擴增效率, 內參基因的擴增效率為 101.2%, MSTN-1的擴增效率為100.2%, MSTN-2的擴增效率為100.3%, 基因擴增效率都接近100%。

數據分析 對目的基因和內參基因進行擴增效率一致性檢測, 結果表明目的基因和內參基因擴增效率相同, 且都接近100%, 故實驗得到的Ct值用2–??Ct法進行分析, 數據以平均值±標準差形式表示(Mean±SD; n=3), 不同處理組數據用單因素方差分析進行顯著性檢驗, 當 P＜0.05時差異顯著, P＜0.01時差異極顯著。

2 結果

2.1 大黃魚不同組織中兩型 MSTN基因的表達差異

在實驗開始時, 對大黃魚不同組織中 MSTN-1 和 MSTN-2的表達進行檢測, 在大黃魚肌肉、腦、脾臟、腎臟、腸和肝臟等6種組織中, MSTN-1在肌肉和腦中表達最高, MSTN-2在腦中表達最高。在肌肉和脾臟中MSTN-1的表達高于MSTN-2, 特別是肌肉中, 1型的表達量約為2型的200倍, 而在腦、腎臟、腸和肝臟組織中, MSTN-2高于MSTN-1的表達,其中腦組織中MSTN-2的表達量約為MSTN-1的5 倍(圖1)。

2.2 饑餓及復投喂對大黃魚肌肉 MSTN基因表達的影響

圖1 大黃魚MSTN-1和MSTN-2在不同組織中的表達Fig. 1 Tissue-specific expression of MSTN-1 and MSTN-2 in Larimichthys crocea

在饑餓處理階段, MSTN-1的表達趨勢是先升后降, 從饑餓處理開始到饑餓21d, 表達上升, 之后顯著下降, 復投喂后, 其表達先升高后降低, 并在復投喂14d, 表達量最低; MSTN-2在饑餓開始階段表達變化不大, 隨著饑餓時間的延長, 其表達上升,并在饑餓 28d表達量最高, 復投喂后表達下降, 但仍顯著高于對照組(圖2)。

2.3 饑餓及復投喂對大黃魚腦 MSTN基因表達的影響

在大黃魚腦中, MSTN-1的表達在饑餓7d后顯著下降, 并在饑餓 35d表達量最低, 復投喂時期表達顯著升高; MSTN-2的表達變化與 MSTN-1不同,在饑餓過程中, 除饑餓 35d外其表達量基本均高于對照組, 復投喂時期表達顯著升高(圖3)。

2.4 饑餓及復投喂對大黃魚脾臟和腎臟 MSTN基因表達的影響

在脾臟(圖4)和腎臟(圖5)中, MSTN-1在饑餓一段時間后表達都顯著下降, 之后有所回升, 但脾臟在饑餓7d顯著下降, 腎臟在饑餓21d顯著下降, 在復投喂階段, 兩個組織中, 復投喂14d MSTN-1的表達量都低于復投喂7d。

在整個饑餓及復投喂階段, MSTN-2在脾臟中的表達呈現的是先升后降的趨勢, 饑餓 21d表達量達到最高, 而在腎臟中呈現的大致趨勢是先降后升的,并且在饑餓21d表達量最低。

2.5 饑餓及復投喂對大黃魚腸和肝臟 MSTN基因表達的影響

在腸(圖6)和肝臟(圖7)中, MSTN-1的表達在饑餓7d、28d和復投喂14d都有顯著升高, 并在饑餓28d表達量達到最高, 在其他階段都顯著低于對照組, 在饑餓 35d的肝臟中未檢測到其表達; 腸中MSTN-2在饑餓7d和21d表達量顯著下降, 在肝臟中僅在饑餓 21d顯著下降, 其他階段表達量均顯著高于對照組, 相對于1型, 在饑餓35d, 肝臟中2型的表達量相對較高。

圖2 饑餓及復投喂對大黃魚肌肉組織中MSTN-1(A)和MSTN-2 (B)表達的影響Fig. 2 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the muscles of Larimichthys crocea

圖3 饑餓及復投喂對大黃魚腦組織中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表達的影響Fig. 3 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the brain of Larimichthys crocea

圖4 饑餓及復投喂對大黃魚脾臟組織中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表達的影響Fig. 4 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the spleen of Larimichthys crocea

圖5 饑餓及復投喂對大黃魚腎組織中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表達的影響Fig. 5 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the kidney of Larimichthys crocea

圖6 饑餓及復投喂對大黃魚腸組織中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表達的影響Fig. 6 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the intestine of Larimichthys crocea

圖7 饑餓及復投喂對大黃魚肝臟組織中MSTN-1 (A)和MSTN-2 (B)表達的影響Fig. 7 Effects of fasting and refeeding on the expression of MSTN-1 (A) and MSTN-2 (B) in the liver of Larimichthys crocea

3 討論

在哺乳動物中, MSTN的作用主要是抑制肌肉生長和發(fā)育[1], 由于基因組復制, 在部分硬骨魚類中產生了兩種類型的 MSTN, 且兩者組織表達模式并不相同。我們在之前的研究中, 利用半定量 PCR技術, 發(fā)現大黃魚MSTN-1主要在肌肉、腦、脾臟、腸等組織中表達, MSTN-2主要在腦中表達[22], 本文采用熒光實時定量PCR方法研究兩種類型MSTN的表達, 1型在肌肉和腦中表達最高, 2型在腦中表達最高, 與之前報道中表達量較高的幾個組織基本一致, 此外本文腸中 MSTN-1的表達量較低, 而之前研究中腸的表達量相對較高, 這種差異可能與不同的實驗方法有關。在斑馬魚中, MSTN-1主要在白肌、腦、心臟等組織中表達, MSTN-2主要在腦、脾臟中表達[13]。在羅非魚(Oreochromis mossambicus)[23]和金鯛[14, 15]中, MSTN-1主要在肌肉、腦和腸中表達, MSTN-2則主要在腦中表達。

饑餓處理之后進行復投喂, 魚類進入補償生長階段, 在這個過程中, 魚攝食增加, 體內進行大量的合成代謝, 生長速率加快。生長激素(Growth hormone, GH)、類胰島素生長因子(Insulin-like growth factors, IGFs)等與生長相關的基因參與調控, GH和IGFs可以促進蛋白質合成, 而MSTN是肌肉生長分化的負調控因子, 促進蛋白質的分解代謝[24]。兩類功能不同的基因在應對饑餓壓力時, 其表達變化也是不同的。研究發(fā)現, 大馬哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)經饑餓處理后IGF-1的表達下降[25], 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)在饑餓處理后 IGF-1表達下降, 復投喂過程中IGF-1的表達上升[26, 27]。金鯛在饑餓初期, 肌肉中 MSTN-1的表達上升[32], 黑鱸在饑餓4周后, 白肌中MSTN-1表達上升, 復投喂后,表達下降[20]。本研究得到的結果與黑鱸的研究結果一致, 在大黃魚肌肉中, MSTN-1在饑餓21d之前表達升高, 復投喂14d后表達顯著下降, 而MSTN-2的表達也是在饑餓階段表達上升, 復投喂階段表達下降。我們已經通過轉基因技術證實大黃魚 MSTN-1可以調控肌肉生長[28], 在本研究中2型與1型在大黃魚肌肉中表達變化趨勢相似, 其功能是否與MSTN-1相似, 還有待研究。已有報道, 在斑馬魚中,過量表達 MSTN-2, 肌肉量下降, 出現肌肉萎縮[29],說明 MSTN-2也可能與肌肉生長調控相關。Santis 等[21]對尖吻鱸的研究顯示, MSTN-1在饑餓處理后表達上升, 而2型表達未發(fā)生變化, 推測兩型MSTN的表達變化的不同, 可能是由于 MSTN-2在啟動子區(qū)域缺少糖皮質激素響應因子, 糖皮質激素可以通過和響應因子結合而上調MSTN的表達[30, 31]。在斑馬魚中, 饑餓上調MSTN的表達, 可以激活SMAD信號通路, SMAD蛋白復合體抑制MyoD的轉錄, 進而抑制肌肉的生長與發(fā)育[32]。在羅非魚中, 饑餓3d導致MSTN-1的表達上升, 但9d后其表達下降[33], 對不同品系的斑馬魚進行饑餓處理, MSTN-1和MSTN-2的表達變化也不相同[34], 在鯰肌肉中MSTN-1的表達不受饑餓處理的影響[35]。

MSTN在腦中的功能目前還沒有直接驗證, 對小鼠腦中MSTN的表達進行研究, 發(fā)現MSTN在海馬體和大腦皮層中都有表達, 在嗅覺區(qū)域, MSTN主要在嗅皮質區(qū)表達, 在嗅球及丘腦區(qū)則主要是生長分化因子-11(Growth and differentiation factor-11, GDF-11)廣泛表達, 研究發(fā)現GDF-11對神經發(fā)生有一定作用[36], 而在多數魚類腦中 MSTN-2都高度表達, 推測MSTN-2也與神經系統(tǒng)的發(fā)育有關。Santis 等[21]發(fā)現鱸在饑餓30d后, 腦中MSTN-1表達下調, 而 MSTN-2的表達相對較穩(wěn)定, 認為兩者表達變化的不同在于糖皮質激素對其的調節(jié)。在本研究中顯示大黃魚腦中 MSTN-1在饑餓初期表達升高, 之后顯著下降, 并在饑餓35d時表達最低, MSTN-2在饑餓期間, 表達量基本都要高于對照組, 兩者在饑餓處理期間表達變化不同, 這與鱸的研究結果不同,暗示大黃魚腦組織中MSTN的表達可能受其他因素調控。

脾臟和腎臟是魚類重要的免疫器官, 是淋巴細胞、巨噬細胞和顆粒細胞等增殖分化的主要場所, 鲀在免疫防御系統(tǒng)中有重要作用。紅鰭東方 (Fugu rubripes)在饑餓壓力下, 脾臟中淋巴細胞的增殖轉化能力和巨噬細胞的吞噬能力增強, 但隨著饑餓時間的延長, 增殖轉化能力和吞噬能力下降[37]。且Harms等[38]研究發(fā)現, 美洲白鱸(Morone americana)脾臟TGF-β家族mRNA水平和頭腎巨噬細胞的吞噬活力成反比。在本研究中, 大黃魚脾臟中 MSTN-1和腎臟中的兩型MSTN表達的大致趨勢都是先下降后上升, 這種表達變化可能與其免疫細胞的能力變化有關, 而脾臟中 MSTN-2的表達變化與 MSTN-1不同, 呈現先上升后下降的趨勢, 暗示兩型 MSTN在脾臟中可能有不同的功能。

在饑餓條件下, 肝臟和腸最先受到影響, 主要和它們能夠儲存能源物質有關, 饑餓早期, 肝和腸就會出現萎縮, 對南方鲇仔魚(Silurus meridionalis)的研究發(fā)現, 饑餓6d后, 肝細胞出現核仁解體現象[39]。在饑餓處理過程中, 由 TGFβ介導的細胞凋亡增加,并且抑制細胞增殖, 導致肝臟體積顯著減小, 發(fā)生萎縮[40—43]。在本研究中, 饑餓初期, 肝臟中兩型MSTN的表達都上升, 肝臟的體積也明顯變小, 這與Santis等[21]對鱸的研究結果一致, 推測在肝臟中, MSTN可能參與了相關調控。

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EFFECTS OF FASTING AND REFEEDING ON THE EXPRESSION OF MSTN IN LARGE YELLOW CROAKER (LARIMICHTHYS CROCEA)

HAN Ming-Xing and XUE Liang-Yi
(Collaborative Innovation Center for Zhejiang Marine High-Efficiency and Healthy Aquaculture, College of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study, we used real-time PCR to investigate the effects of fasting and re-feeding on the expression of two MSTN genes in large yellow croaker (Larimichthys crocea). The results showed that during the 35-day fasting treatment, the expression of MSTN-1 and MSTN-2 in skeletal muscles firstly increased and then decreased, and their expressions perked on the 21st and the 28th day respectively. The expressions were down-regulated during the re-feeding period. The expression patterns of the two MSTNs were different in the brain, although they both reached the lowest level on the 35th day and then increased after re-feeding. In the spleen the expressions of MSTN-1 and MSTN-2 reached to the highest levels on the 28th and the 21st days respectively, and both declined after the re-feeding. In kidney the expression patterns of the two genes were similar, and they both reached the lowest on the 21st day after fasting followed by an increase. The expression of MSTN-1 and MSTN-2 in the intestine decreased significantly on the 14th and the 7th day respectively, and then peaked on the 28th day. In the liver, the expression of MSTN-1 and MSTN-2 decreased sharply on the 21st day and then increased. The expressions of both genes were up-regulated after re-feeding. Our findings suggested that the functions of the two MSTN genes might be various in different tissues.

Larimichthys crocea; Myostatin; Real-time PCR; Fasting; Re-feeding

S917.4

A

1000-3207(2015)04-0669-08

10.7541/2015.89

2014-07-18;

2015-01-06

國家自然科學基金(30871916,31172398); 浙江省自然科學基金(LY15C190005); 浙江省科技廳項目(2012C12907-8)資助

韓明星(1989—), 女, 河南焦作人; 碩士研究生; 研究方向為水產生物分子生物學。E-mail: hanmingxing100@163.com

薛良義, E-mail: xueliangyi@nbu.edu.cn