NaNO3脅迫對兩種微囊藻VOCs釋放的影響

甘麗平 徐慶歡 楊王庭 趙靜嫻 周 律 張汝民 高 巖 左照江

(浙江農林大學林業與生物技術學院, 臨安 311300)

NaNO3脅迫對兩種微囊藻VOCs釋放的影響

甘麗平 徐慶歡 楊王庭 趙靜嫻 周 律 張汝民 高 巖 左照江

(浙江農林大學林業與生物技術學院, 臨安 311300)

為了揭示硝酸鹽過量積累對藻類產生脅迫后對藻類揮發性有機化合物(VOCs)釋放以及水體氣味的影響, 研究以形成藍藻水華的主要種類銅綠微囊藻和水華微囊藻為材料, 在 NaNO3脅迫下, 對其細胞生長和釋放的VOCs進行測定分析。結果表明, NaNO3脅迫24h后, 銅綠微囊藻和水華微囊藻細胞生長均受到明顯影響, 與對照相比細胞密度分別降低了29.6%和 43.0%。在正常條件下, 銅綠微囊藻和水華微囊藻分別釋放出26和27種化合物, 其主要類型是硫化物、烴類、萜烯類、苯類、醛類和酯類化合物。在NaNO3脅迫下, VOCs含量均明顯增加, 其中銅綠微囊藻釋放的此6類VOCs含量分別增加了60.5%、14.3%、136.6%、92.1%、730.0% 和 120.7%, 水華微囊分別增加了 172.7%、162.5%、154.0%、55.9%、51.2%和 109.4%。此外, 銅綠微囊藻VOCs中出現4種新成分, 水華微囊藻VOCs中出現1種新成分。由此可見, 硝酸鹽過量積累對藻細胞產生脅迫后會誘導其釋放出大量VOCs, 從而增加水體氣味、破壞水質。

細胞生長; 微囊藻; 硝酸鈉; 脅迫; 揮發性有機化合物

在陸地生態系統中, 高等植物通過次生代謝途徑合成并釋放的揮發性有機化合物(Volatile organic compounds, VOCs)大約有30000多種[1, 2], 這些VOCs可為植食性動物侵食與病原菌侵染等生物脅迫以及高溫、干旱和鹽害等非生物脅迫所誘導產生[3—6], 并作為信號物質以實現其信息傳遞的生態功能[7—10]。

除高等植物外, 在水域生態系統中藻類植物也會產生大量 VOCs, 然而其研究報道卻相對較少。Zuo等[11, 12]研究發現, 萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)釋放的 VOCs種類豐富, 其主要類型為醛類、醇類、酯類、酮類、萜烯類、烷烴類和烯烴類化合物。銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)釋放的VOCs主要是C15-C20脂肪族烴、臭樟腦、萜烯類、β-環檸檬醛、β-紫羅酮等化合物[13]。Huang等[14]測定魚腥藻(Anabeana)、微囊藻、顫藻(Oscillatoria)等3種藍藻釋放到水體中的 VOCs發現, 土味素和 2-甲基異莰醇大量存在, 從而使水體呈泥土氣味[15]。當采用乙酸、NaCl和Na2CO3對萊茵衣藻進行酸、堿、鹽脅迫處理后, 其VOCs釋放量均明顯增加, 同時乙酸和NaCl脅迫還可誘導C6綠葉揮發物(Green leaves volatiles, GLVs)釋放[11, 12]。由此可見, 非生物脅迫具有誘導藻類細胞釋放VOCs的作用。

隨著經濟社會發展, 由污水排放、過量施肥滲漏、大氣中氮沉降等原因造成的水體氮源含量升高并由此導致的富營養化狀況已十分嚴峻[16—18]。在水體氮源中, 硝酸鹽是其主要成分之一, 例如, 太湖水體主要以硝酸鹽為主[19]。雖然水體富營養化會導致藍藻大量生長進而破壞水質[14, 15, 20], 但是硝酸鹽過量積累對藻類產生脅迫后對其VOCs釋放以及水體氣味有何影響, 目前尚無相關報道。因此, 本研究以形成藍藻水華的主要種類銅綠微囊藻(M. aeruginosa)和水華微囊藻(M. flosaquae (Wittr). Kirchner)為材料, 通過分析其在NaNO3脅迫下VOCs釋放與成分變化, 以期揭示硝酸鹽脅迫對藻類 VOCs釋放以及水體氣味的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

水華微囊藻 FACHB-912株系和銅綠微囊藻FACHB-1028株系均購于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫, 此兩種微囊藻均隸屬于藍藻門

(Cyanophyta)色球藻目(Chroococcales)微囊藻科(Microcystaceae)微囊藻屬(Microcystis)。所用培養基均為BG11培養基(1 mol/L NaOH調節pH至 7.1),培養條件為: 溫度 25 , ℃ 光照(16h)/黑暗(8h), 光強50 μmol/(m2·s), 搖床轉速100 r/min。待藻細胞密度達到對數生長期時, 用于實驗處理。

1.2 NaNO3脅迫處理

將處于對數生長期的微囊藻, 5000 r/min離心5min, 棄去上清, 將底部沉淀的微囊藻細胞轉入含有70.4 mmol/L NaNO3(BG11標準培養基NaNO3濃度的4倍)的培養液(1 mol/L NaOH調節pH至7.1),藻細胞密度為5×106個細胞/mL。以轉入BG11標準培養基(NaNO317.6 mmol/L)作為對照。3次重復。培養24h后, 對藻細胞密度及其釋放的VOCs進行測定。

1.3 VOCs采集與成分分析

利用QC-2型大氣采樣儀(北京市勞動保護科學研究所科技發展公司)采用動態頂空套袋采集法收集微囊藻 VOCs[11, 12], 對室內空氣進行采氣作為空白對照。采氣時間為40min, 采氣流量為0.3 m3/min。

氣體組分分析采用熱脫附/氣相色譜/質譜聯用法分析(Thermal-desorption Systerm/Gas Chromatography/Mass Spectrum, TDS/GC/MS)。TDS(TDS-3型,德國Gerstel公司)工作條件: 系統載氣壓力為20 kpa,進樣口溫度為250 , ℃ 脫附溫度為250 (10min),冷℃阱溫度為–120 (℃ 保持3min), 冷阱進樣時溫度為260℃。GC (GC 7890A, 美國Agilent公司)工作條件:色譜柱為30 m×250 μm×0.25 μm的HP-5MS柱, 程序升溫: 初始溫度為40 , ℃ 保持4min后以6 /min℃ 的速率升至250 , ℃ 保持3min后以10 /min℃ 的速率升溫到270 , ℃ 保持5min。MS (MS 5975C, 美國Agilent公司)工作條件: 電離方式為El, 電子能量為70 eV, 質量范圍是28—450 aum, 接口溫度280 , ℃ 離子源溫度為230 , ℃ 四級桿溫度為150℃。

GC/MS質量數據從 NIST/EPA/NIH 質譜庫(NIST 08)中獲得, 根據細胞密度計算 107個細胞釋放的VOCs峰面積以表示VOCs成分的相對含量。

1.4 數據處理

實驗中所測數據利用SPSS 13.0軟件采用t檢驗進行顯著性分析, 采用Origin 8.0軟件進行作圖。

2 結果

2.1 NaNO3脅迫對兩種微囊藻細胞生長的影響

銅綠微囊藻和水華微囊藻在正常條件下培養24h后, 與初始值相比其細胞密度分別增加了71.2% 和 76.5%, 并且差異均達到極顯著水平(P＜0.01); 而在 NaNO3脅迫下, 細胞密度分別增加了 20.5% (P＜0.01)和0.7%。在NaNO3處理24h時, 與對照相比, 兩種藻細胞生長均受到明顯影響, 分別降低了29.6% (P＜0.01)和43.0% (P＜0.01) (圖1)。

2.2 NaNO3脅迫對銅綠微囊藻VOCs釋放的影響

圖1 NaNO3脅迫對兩種微囊藻細胞生長的影響Fig. 1 The effects of NaNO3stress on the cell growth of the two Microcystis

在正常條件下, 銅綠微囊藻釋放的 VOCs中含有26種化合物, 其主要成分是甲基異丙基二硫醚、異丙基(化)二硫、桉樹腦、長葉烯、十五烷和丙酸-2-甲基-1-(1,1-二甲基乙基)-2-甲基-1,3-丙二基酯, 峰面積分別為7.13×106、2.26×106、3.11×106、2.60×106、2.22×106和 5.55×106/107細胞。在 NaNO3脅迫下, VOCs成分增加到28種, 其中新出現化合物4種,分別是α-蒎烯、2-乙基己醛、乙酸異辛酯和2,6,10-三甲基十四烷; 消失的化合物2種, 分別是2,4-二甲基-2,3-庚烯-5-炔和雙環[4.4.1]-十一-1,3,5,7,9-五烯。除此之外, 其余各VOCs成分含量均明顯增加(表1)。

銅綠微囊藻在正常條件下釋放的VOCs中含有8種含氧化合物, 分別是桉樹腦、1,7,7-三甲基-二環[2.2.1]庚-2-酮、環檸檬醛、2,3,5-三甲基苯甲醚、(Z)-7-十六烯醛、2,6-二叔丁基對苯醌、丙酸-2-甲基-1-(1,1-二甲基乙基)-2-甲基-1,3-丙二基酯和鄰苯二甲酸二異丁酯。在NaNO3脅迫下, 除各含氧化合物含量均明顯增加外, 還出現 2-乙基己醛和乙酸異辛酯2種新含氧化合物(表1)。

表1 NaNO3脅迫對銅綠微囊藻VOCs釋放的影響Tab. 1 The effects of NaNO3 stress on the release VOCs from M. aeruginosa

對銅綠微囊藻 VOCs進行歸類分析, 其主要類型有硫化物、烴類、萜烯類、苯類、醛類和酯類化合物。在NaNO3脅迫后, 各類化合物含量均明顯增加, 與對照相比, 分別增加了 60.5%、14.3%、136.6%、92.1%、730.0%和 120.7%, 并且差異均達到極顯著水平(P＜0.01) (圖2)。

2.3 NaNO3脅迫對水華微囊藻VOCs釋放的影響

在正常條件下, 水華微囊藻釋放的 VOCs中含有 27種化合物, 其主要成分是甲基異丙基二硫醚(8.15×106/107細胞)、甲基苯乙烯(1.18×106/107細胞)、異丙基(化)二硫(4.37×106/107細胞)、桉樹腦(3.99×106/107細胞)、環檸檬醛(1.32×106/107細胞)和長葉烯(2.14×106/107細胞)。在NaNO3脅迫后, VOCs中出現了雪松烯 1種新成分, 同時其他各成分含量均明顯增加(表2)。

圖 2 NaNO3脅迫對銅綠微囊藻VOCs種類釋放量的影響Fig. 2 The effects of NaNO3stress on the types of and amounts of VOCs released from M. aeruginosa

表2 NaNO3脅迫對水華微囊藻VOCs釋放的影響Tab. 2 The effects of NaNO3stress on the release of VOCs from M. flos-aquae

與銅綠微囊藻相似, 水華微囊藻也會釋放出含氧VOCs, 其種類為10種, 并且在NaNO3脅迫下含量均明顯增加(表2)。

與銅綠微囊藻 VOCs種類相同, 水華微囊藻VOCs的種類也主要有硫化物、烴類、萜烯類、苯類、醛類和酯類化合物。在NaNO3脅迫后, 各類化合物含量分別增加了 172.7% (P＜0.01)、162.5% (P＜0.01)、154.0% (P＜0.01)、55.9% (P＜0.01)、51.2% (P＜0.01)和109.4% (P＜0.01) (圖3)。

圖 3 NaNO3脅迫對水華微囊藻VOCs種類釋放量的影響Fig. 3 The effects of NaNO3stress on the types of and amounts of VOCs released types from M. flos-aquae

3 討論

在水域生態系統中, 藻類植物可通過次生代謝途徑釋放大量的 VOCs, 在非生物脅迫下其釋放量會明顯增加。例如, 剛毛藻(Cladophora glomerata)的野外生長溫度為12 , ℃ 當將其培養在23℃條件時,其釋放的3種鹵代烴量均明顯增加[21]。采用pH 5.0乙酸處理萊茵衣藻2h, 其VOCs釋放量最大、化合物種類最多[11]。采用 300 mmol/L NaCl和150 mmol/L Na2CO3處理萊茵衣藻也能誘導其釋放大量的 VOCs, 但其成分間存在較大差異, 其中300 mmol/L NaCl可誘導釋放 GLVs——己醛, 而150 mmol/L Na2CO3則誘導釋放3,4-二甲基-己烷和5-甲基-2-庚烯等特異性成分[12]。在 NaNO3脅迫下,兩種微囊藻VOCs的釋放量均明顯增加(圖2、3), 同時銅綠微囊藻產生 4種新化合物, 水華微囊藻產生1種新化合物(表1、2)。由此可見, 非生物脅迫不僅會促進VOCs釋放, 還可誘導新化合物形成。

植物體內的萜烯類化合物種類豐富, 其合成途徑主要有細胞質中的甲羥戊酸途徑和葉綠體中的脫氧木酮糖-5-磷酸途徑[22]。在高溫、鹽等脅迫條件下,此合成過程的相關酶(例如: 1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸合成酶、1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸羥酸還原異構酶和異戊烯基焦磷酸酶)大量合成, 從而促進萜烯類VOCs釋放[23—25]。對于含有苯環的芳香族化合物,其合成來源于苯丙氨酸[26]。例如, 水楊酸為含苯VOCs, 病原菌侵染和 O3脅迫可通過誘導相關酶基因表達而促進其釋放[27]。在NaNO3脅迫下, 萜烯類和苯類化合物釋放量均明顯增加, 這可能與 NaNO3誘導相關合成酶基因的表達有關, 然而其具體機制尚需進行深入研究。

含硫化合物是某些植物中所特有的VOCs成分,例如芥子油甙為十字花科植物所特有, 可為昆蟲取食所誘導釋放[28]。兩種微囊藻在NaNO3脅迫下, 甲基異丙基二硫醚和異丙基(化)二硫兩種含硫化合物均大量產生, 然而其具體的形成機制尚不清楚。

在植物釋放的 VOCs中, 醛、酮、醇、呋喃、有機酸、酯和氧化萜烯等均為含氧化合物[29—31]。在NaNO3脅迫下, 銅綠微囊藻和水華微囊藻的含氧VOCs釋放量均明顯增加, 同時銅綠微囊藻還會釋放出2-乙基己醛和乙酸異辛酯2種新含氧化合物(表1、2), 這與乙酸誘導萊茵衣藻發生程序性死亡時, 其含氧VOCs釋放量明顯增加的研究結果相類似[32]。

研究表明, VOCs中含有不飽和鍵的化合物易于被活性氧(Reactive oxygen species, ROS)氧化而形成含氧化合物[32—36], 例如異戊二烯可被HO·氧化形成2-甲基呋喃[31], β-蒎烯可被O3氧化為降蒎酮[37]。鹽脅迫可誘導藻細胞產生大量的 ROS, 例如 NaCl和KCl脅迫處理小球藻(Micrasterias denticulate) 5min 后, 其細胞內ROS便大量產生[38]; 20、50、100和300 mmol/L NaCl處理萊茵衣藻30min后, 其細胞內O2–.和H2O2含量均明顯增加, 并且ROS含量隨鹽濃度增加而增加[39]。在NaNO3脅迫下, 微囊藻細胞中的ROS勢必會大量產生, 這些ROS可能會參與VOCs中含氧化合物形成, 從而促進含氧VOCs釋放。

由此可見, 水體中硝酸鹽過量積累對藻細胞造成脅迫后會誘導其釋放出大量的 VOCs, 同時脅迫誘導藻細胞產生的ROS可能會參與VOCs中含氧化合物的形成。這些藻類VOCs的大量產生勢必會導致水體氣味增加, 進而破壞水質。

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THE EFFECTS OF NaNO3STRESS ON THE RELEASE OF VOCs FROM TWO MICROCYSTIS

GAN Li-Ping, XU Qing-Huan, YANG Wang-Ting, ZHAO Jing-Xian, ZHOU Lü, ZHANG Ru-Min, GAO Yan and
ZUO Zhao-Jiang
(School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China)

Nitrate is one of the major sources of pollution in water bodies. To reveal how the excessive nitrate accumulation affects the release of VOCs and causes the odor in the water, we analyzed the cell growth and VOCs from Microcystis aeruginosa and M. flosaquae--the primary species responsible for the cyanobacterial bloom--under the NaNO3stress. Compared to the control NaNO3significantly reduced the cell growth of M. aeruginosa and M. flos-aquae by 29.6% and 43.0% respectively after the 24h stress. Under the normal condition, M. aeruginosa and M. flosaquae released 26 and 27 compounds respectively, and the major types of VOCs were sulphide, hydrocarbons, terpenoids, benzenes, aldehydes and esters. In M. aeruginosa the release of these 6 VOCs was remarkably increased by 60.5%, 14.3%, 136.6%, 92.1%, 730.0% and 120.7% respectively after the NaNO3treatment, and the increments in M. flos-aquae were 172.7%, 162.5%, 154.0%, 55.9%, 51.2% and 109.4% respectively. In addition, 4 new compounds were found in VOCs of M. aeruginosa under the NaNO3stress, and 1 new compound was found in VOCs of M. flosaquae. Therefore, the stress of excessive nitrate accumulation on algae may promote the release of VOCs, which could aggravate the odor and the quality of the water.

Cell growth; Microcystis; NaNO3; Stress; Volatile organic compounds

Q142

A

1000-3207(2015)04-0782-07

10.7541/2015.102

2014-12-29;

2015-03-06

國家自然科學青年基金項目(31300364); 浙江農林大學科研發展基金人才啟動項目(2013FR069)資助

甘麗平(1993—), 女, 貴州貴定人; 學士; 主要從事藻類VOCs研究。E-mail: 1095252032@qq.com

左照江, E-mail: zuozhaojiang@126.com