缺氧預處理誘導大鼠心肌細胞差異表達microRNA的芯片篩選與生物信息學分析

何淑芳，朱海娟，程　潔，許士進，楊　婉，張　野(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉科，安徽合肥　230601)

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缺氧預處理誘導大鼠心肌細胞差異表達microRNA的芯片篩選與生物信息學分析

何淑芳，朱海娟，程潔，許士進，楊婉，張野
(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉科，安徽合肥230601)

中國圖書分類號: R-332; R322.11; R342.2; R394. 2; R845. 22

摘要:目的篩選缺氧預處理(hypoxia preconditioning，HPC)誘導成年大鼠心肌細胞差異表達的microRNA(miRNA)，并預測分析miRNA調控的靶基因與功能。方法體外分離培養成年大鼠心室肌細胞，分為對照組(CON)和缺氧預處理組(HPC)，CON組細胞正常培養，HPC組細胞經歷10 min缺氧和30 min再給氧，提取心肌細胞總RNA，行miRNA芯片篩選，qRT-PCR驗證芯片結果。利用軟件預測差異表達miRNA調控的靶基因，分析靶基因富集的基因功能(gene ontology，GO)和信號通路(pathway)。結果與CON組相比，HPC可誘導大鼠心肌細胞miRNA表達譜發生明顯改變，共有12 個miRNA上調，14個miRNA下調(P＜0. 01，FDR＜0. 05);選擇其中熒光信號值＞500的7個miRNA，用于生物信息學分析。qRT-PCR檢測miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216水平，變化趨勢與芯片結果一致。生物信息學分析顯示差異表達miRNA所調控的靶基因功能明顯富集于27個GO和6條信號通路。結論HPC可誘導成年大鼠心肌細胞miRNA表達譜明顯改變，這些差異表達miRNA可能通過調控靶基因參與HPC介導的心肌細胞保護作用。

關鍵詞:心肌細胞;成年大鼠;缺氧預處理; microRNA;芯片;生物信息學

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.011.html

張野(1968－)，男，博士，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向:麻醉藥理學，通訊作者，Tel: 0551-63869480，E-mail: zhangye_hassan@ sina.com

缺血性心臟病嚴重危害人類健康，在全球前10位死亡原因中居于首位［1］。心肌缺血導致急性心肌梗死后，盡早通過溶栓、冠狀動脈介入或搭橋手術等方法恢復缺血心肌組織灌注是最有效的治療措施，然而再灌注本身會引起心肌缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)，不但降低再灌注的臨床療效，而且可能增加急性心肌梗死后的死亡率和心力衰竭發生率。如何預防或減輕心肌IRI，已成為目前心臟病學領域的研究熱點。

自1986年Murry等［2］提出缺血預處理(ischemic preconditioning，IPC)的概念以來，大量研究已經證實了IPC的心肌保護作用，但其確切機制仍不清楚。microRNA(miRNA)是一類由18～25個核苷酸組成的小分子RNA，在轉錄后水平調節靶基因的表達，參與各種疾病病理生理過程。近年研究表明miRNA通過調控心肌細胞的凋亡或氧化應激，在心肌缺血、再灌注、預處理等過程中均發揮重要作用［3］。心肌細胞缺氧預處理(hypoxia preconditioning，HPC)可以模擬體內IPC，有助于心肌細胞對抗之后更嚴重的缺氧性損傷，抑制心肌細胞凋亡［4］，是體外研究IPC作用與機制的重要手段。本研究利用miRNA芯片研究HPC對成年大鼠心肌細胞miRNA表達譜的影響并分析其靶基因功能，擬從miRNA水平初步探討IPC保護心肌IRI的作用機制。

1　材料

1.1實驗動物清潔級成年♂SD大鼠購自江蘇大學實驗動物中心(合格證批號: SCXK(蘇)2009-0002)。

1.2主要試劑及儀器M199培養基、TRIzol(Invitrogen)，DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養基(Gibco)購自Life Technologies公司;新生牛血清(NBS)購自杭州四季青公司; 2，3-Butanedione monoxine(BDM)、Insulin-transferring-selenium(ITS)、牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司; All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit(AQMD-020)及miRNA引物購于廣州復能基因公司; microRNA微陣列芯片由LC Sciences公司提供。主要儀器包括缺氧小室(加拿大Stem Cell公司); Langendorff離體心臟灌流裝置(淮北正華生物儀器設備有限公司); Agilent Bioanalyzer 2100，Mx3000PTMReal Time PCR擴增儀(美國Agilent公司)等。

2　方法

2.1分離培養正常大鼠心室肌細胞參照文獻［5］并加以改進分離成年大鼠心室肌細胞。正常大鼠斷頭處死后取出心臟，主動脈逆行插管，經Langendorff灌流、Ⅱ型膠原酶消化、梯度復鈣、差速貼壁等步驟獲得鈣耐受的活細胞，桿狀細胞率＞80%。分離成功的細胞置于5% CO2、37℃培養箱內，在含ITS、BDM、BSA的M199培養基內進行培養。

2.2心肌細胞缺氧預處理原代培養大鼠心肌細胞分為2組，每組4例(n =4):對照組(CON)、缺氧預處理組(HPC)。HPC組心肌細胞培養液更換為低糖(5 mmol·L－1)、無血清DMEM，置于缺氧小室中，并沖入95% N2+ 5% CO2以驅走O2造成缺氧環境，將密閉的缺氧小室放入培養箱，37℃下缺氧培養10 min，隨后更換含10% NBS的高糖(25 mmol ·L－1)DMEM培養液，5% CO2、95 %空氣、37℃培養30 min。對照組細胞在含10% NBS的高糖DMEM培養液中正常培養。預處理后即刻收集心肌細胞，提取RNA用于miRNA芯片分析。

2.3 microRNA芯片檢測分析心肌細胞給予HPC后，立即收集心肌細胞，TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，采用Agilent Bioanalyzer 2100鑒定RNA的純度和質量。利用YM-100微離心濾器將RNA樣品進行大小分別，取5 μg小RNA(＜300nt)，用Poly(A)聚合酶在總RNA 3'端加上Poly(A)尾，并進行熒光標記。雜交反應在uParaflo微流體芯片上過夜進行。檢測探針均使用PGR(photogenerated reagent)化學法進行原位合成。RNA與探針雜交后，與標記特異結合的Cy3染料在微流體芯片上循環流動進行染色。利用激光掃描儀(GenePix 4000B，Molecular Device)采集雜交圖像，使用Array-Pro圖像分析軟件進行圖像數字化轉換，并使用LOWESS過濾(Locally-Weighted Regression)進行信號歸一化。使用genecluster2.0和Cluster3.0分析軟件進行聚類分析(此部分實驗由杭州LC Sciences生物技術有限公司完成)。

2.4熒光定量RT-PCR驗證芯片結果選取芯片中顯著差異表達的miRNA進行驗證。miR-133b-5p、miR-6216、miR-664-1-5p以及內參U6的擴增引物購自廣州復能基因公司(序列保密)。按照Allin-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒說明書，PolyA加尾法逆轉錄RNA，PCR程序設定為:95℃10 min變性，95℃10 s、60℃20 s、72℃10 s重復40個循環進行擴增;熔解曲線程序采用Agilent儀器默認程序。反應結束儀器自動生成CT值(threshold cycles，CT)及熔解曲線圖。熔解曲線呈單一銳利主峰說明PCR產物單一，擴增反應特異性好。每個樣本設3個重復管，同時設無模板陰性對照(NTC)。2－△△CT法計算實驗組相對于空白對照組的miRNA表達的差異倍數［6］。

2.5靶基因預測與功能顯著性分析采用miRNA生物信息學軟件TargetScan、miRanda對芯片檢測的差異表達miRNA(信號值＞500且P＜0. 01)進行靶基因的預測，選擇兩種軟件交集的靶基因。基于GO(Gene ontology)數據庫，應用DAVID軟件根據靶基因的基因功能富集程度(enrichment P-value)，進行GO顯著性分析;基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)數據庫，應用DAVID軟件根據靶基因在信號通路中的富集程度，進行Pathway顯著性分析。計算P值，并根據P值排序計算FDR 值(false discovery rate)［7］。

2.6統計學處理采用SPSS10. 0軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。生物信息學數據分析采用Fisher精確檢驗和卡方檢驗進行統計。

3　結果

3.1 RNA純度及質量鑒定各組RNA樣本的OD260/OD280比值均在1. 8～2. 0之間，RIN≥7. 0，28S/18S≥0. 7，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，5S rRNA條帶較弱，說明RNA樣品完整性好，純度高，無明顯降解，可以用于后續芯片檢測實驗。見Fig 1。

3.2 miRNA表達譜差異及聚類分析miRNA芯片結果顯示，與CON組相比，HPC組共有26個miRNA表達發生明顯變化(P＜0. 01，FDR＜0. 05)，其中12個miRNA上調，14個miRNA下調，明顯差異表達miRNA的聚類分析結果見Fig 2。熒光信號值＞500的miRNA中，2個miRNA(miR-133b-5p，let-7d-5p)明顯上調，5個miRNA(miR-664-1－5p，－6216，－6215，30a－5p，30e－5p)明顯下調(P＜0. 01，FDR＜0.05)。見Tab 1。

3.3熒光定量RT-PCR驗證差異表達miRNA為了驗證miRNA芯片結果，選擇差異表達最為明顯的miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216進行驗證，利用熒光定量RT-PCR法檢測CON與HPC組3種miRNA差異表達情況。結果表明HPC組miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216表達趨勢與芯片結果一致，但變化倍數不同。見Fig 3。

Fig 1　Qualification of total RNA by bioanalyzer The representative analysis results of total RNA in(A)Control group and(B)hypoxia preconditioning group

Tab 1　Differentially expressed miRNAs between CON and HPC groups(n =4，±s)

Tab 1　Differentially expressed miRNAs between CON and HPC groups(n =4，±s)

CON: cardiomyocytes was cultured in normal condition; HPC: cardiomyocytes were subjected to hypoxia for 10 min followed by 30 min reoxygenation.

Signal valueFold change MiRNAs CON　HPC(HPC/CON)　P value rno-miR-133b-5p 　10170±1013 　27852±1208 　2.740.0003 rno-let-7d-5p　3451±311 　4487±381 　1.30 　0.008 rno-miR-664-1-5p 　9563±976 　8200±1049 　0.24　　＜0.0001 rno-miR-6216　1761±262　529±93 　0.30 　0.0002 rno-miR-6215　2446±96 　1715±120 　0.70 　0.0009 rno-miR-30a-5p 　12757±775 　10360±312 　0.81 　0.003 rno-miR-30e-5p 　12117±914 　9544±271 　0.79 　0.009

Fig 2　Hierarchical clustering analysis of differentially expressed miRNAs between CON and HPC groups(P＜0.01，FDR＜0.05，n =4)The colors display miRNA expression variance: red indicates a higher gene expression，green lower expression，and black the median value.

3.4差異表達miRNA靶基因顯著富集的GO與Pathway靶基因GO顯著性分析結果顯示，HPC誘導差異表達miRNA調控的靶基因功能主要富集于27個GO(P＜0. 01，Fig 4A)。其中16個GO涉及生物學過程，包括GTP酶活性的正性調控、磷脂酰肌醇去磷酸化、周期依賴蛋白激酶活性調節、細胞膜融合等;5個GO涉及細胞組分，包括肌動蛋白細胞骨架、轉錄激活復合物、胞核、膜組分、細胞內; 6 個GO涉及分子功能，包括泛素特異性蛋白酶活性、半胱氨酸肽酶活性、氨基酸連接酶活性、RNA聚合酶Ⅱ調控轉錄因子活性等。Pathway顯著性分析顯示靶基因明顯富集于6條信號通路(P＜0. 05，Fig 4B)，分別為Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、Chagas疾病通路、醛固酮調節的鈉重吸收通路、RIG-I樣受體信號通路、TGF-β信號通路。

Fig 3　Validation of miRNAs microarray data via qRT-PCR(±s，n =3)The relative expression value of miR-133b-5p，miR-664-1-5p and miR-6216 were normalized to U6 RNA level.*P＜0.05 vs CON group.

4　討論

miRNA是近年來新發現的一類內源性小分子非編碼RNA，其結合于mRNA的3’UTR區域，通過誘導mRNA的降解、翻譯抑制等形式，在轉錄后水平調節靶基因的表達，參與調控細胞增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學過程。研究人員發現在心臟缺血/再灌注過程中很多miRNA發生改變，并推測在預處理過程中發生改變的miRNA可能對抗心肌缺血/再灌注損傷，發揮心肌保護作用［8］。

Fig 4　GO and KEGG pathway analysis ondifferentially expressed miRNAsA: 27 GO terms enriched in hypoxia preconditioning; B: 6 KEGG pathways enriched in hypoxia preconditioning.The -lgP is the negative logarithm of the P-value.

我們前期研究發現缺氧10 min/復氧30 min的預處理可以減輕大鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷，抑制心肌細胞凋亡［9］。本研究利用miRNA芯片技術，篩選HPC誘導大鼠心肌細胞差異表達的miRNA，miRNA表達譜芯片技術一種新型高通量、廣譜的基因篩選方法，具有較高的特異性和敏感性。我們通過芯片篩選發現，HPC誘導大鼠心肌細胞中共26個miRNA發生明顯改變，選擇差異表達最為顯著的miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216進行qRTPCR檢測驗證，結果與芯片結果基本一致，說明芯片檢測結果準確可靠。在這些明顯差異表達的miRNA中，miR-133b與miR-133a同屬于miR-133家族，兩者具有很高的同源性，已知miR-133a具有抗心肌細胞凋亡作用，在心肌IRI過程中表達下調但可被IPC上調［10］，然而miR-133b在心肌細胞凋亡中的作用機制尚不明確。miR-30家族也在心血管疾病中發揮重要作用，最新研究發現，大鼠心肌梗死誘導miR-30家族表達上調，抑制miR-30家族表達可以對抗心肌缺血后損傷，發揮心肌保護作用。而其他miRNA如miR-664-1-5p、let-7d-5p、miR-6216、miR-6215等在心肌缺血/再灌注過程中的作用尚未見報道。

miRNA芯片檢測結合生物信息學分析有助于更好地了解miRNA調控的靶基因功能與涉及的信號通路，可以提高芯片分析的研究效率和準確性。我們同時利用Targetscan、miRanda兩個靶基因預測軟件預測差異表達miRNA可能調控的靶基因，并選擇兩種軟件交集的靶基因，以避免單一軟件預測的假陽性。通過對靶基因所富集的GO(基因功能)和Pathway(信號通路)進行分析，發現HPC誘導差異表達miRNA所調控的靶基因功能明顯富集于27個GO，主要涉及細胞周期調控、激酶活性、細胞信號轉導、細胞泛素化調節、轉錄因子活性調節等。靶基因投射的6條信號通路中，已知Toll樣受體信號通路通過調節免疫和炎癥反應，在心肌缺血/再灌注損傷中發揮至關重要的作用［11－12］; MAPK信號通路參與調控心肌細胞凋亡［13－14］、TGF-β信號通路在心肌梗死后重塑和心肌纖維化中發揮重要作用［15］;而其他3條信號通路在心肌缺血/再灌注損傷中的作用尚不明確。

綜上所述，本研究利用miRNA表達譜芯片及生物信息學技術，篩選出HPC誘導心肌細胞明顯差異表達的miRNA，并對其調控的靶基因和信號通路進行預測分析，從miRNA角度初步探討了HPC發揮心肌細胞保護作用的可能機制，為進一步深入研究HPC的miRNA調控機制提供了基礎。

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Screening and bioinformatics analysis of differentially expressed miRNAs induced by hypoxia preconditioning in rat cardiomyocytes

HE Shu-fang，ZHU Hai-juan，CHENG Jie，XU Shi-jing，YAN Wan，ZHAGN Ye
(Dept of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601，China)

Abstract:Aim To screen the differentially expressed microRNAs(miRNAs)induced by hypoxia preconditioning(HPC)in adult rat cardiomyocytes，and predict miRNAs-regulated target genes and their functions.Methods Cardiomyocytes were isolated from adult rat ventricular myocardium and cultured(in vitro).The cells were divided into 2 groups: control group(CON)and hypoxia preconditioning group(HPC).The cardiomyocytes in HPC group were subjected to 10 min hypoxia followed by 30 min reoxygenation，while the cells in CON group were cultured under normal condition.After that，total RNA was extracted and then subjected to miRNA microarray to screen differentially expressed miRNAs.The microarray results were further validated by quantitative RTPCR(qRT-PCR).Bioinformatics analysis was performed to predict the miRNAs-regulated target genes and analyze the enriched gene ontology(GO)and signaling pathway(Pathway).Results HPC caused significant changes in miRNAs expression in cardiomyocytes as compared to CON group.A total of 12 miRNAs were up-regulated and 14 miRNAs were down-regulated(P＜0. 01，FDR＜0.05).The differentially expressed 7 miRNAs with a fluorescent signal intensity ＞500 were selected for further bioinformatics analysis.The expression of miR-133b-5p，miR-664-1-5p and miR-6216 detected by qRT-PCR exhibited the similar patterns of up or down regulation to those shown in microarray results.Bioinformatics analysis revealed that miRNAs-regulated target genes were significantly enriched in 27 GOs and 6 signal pathways.Conclusion

The expression profile of miRNAs in rat cardiomyocytes is significantly affected by HPC.These differentially expressed miRNAs might participate in HPC-induced cardioprotection by regulating their target genes in rat cardiomyocytes.

Key words:cardiomyocytes; adult rat; hypoxia preconditioning; microRNA; microarray; bioinformatics

作者簡介:何淑芳(1977－)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向:麻醉藥理學，E-mail: hsf77 @163.com;

基金項目:國家自然科學基金課題(No 81200171);安徽省科技廳年度重點項目(No 1301043030);高校省級自然科學研究重大項目(No KJ2014ZD16)

收稿日期:2015－03－15，修回日期:2015－04－30

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0940－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.011